Imunomodulatorni metaboliti su ključna karakteristika tumorskog mikrookruženja (TME), ali uz nekoliko izuzetaka, njihov identitet ostaje uglavnom nepoznat. Ovdje smo analizirali tumore i T ćelije iz tumora i ascitesa pacijenata sa seroznim karcinomom visokog stepena (HGSC) kako bismo otkrili metabolom ovih različitih TME odjeljaka. Ascites i tumorske ćelije imaju velike razlike u metabolitima. U poređenju sa ascitesom, T ćelije koje infiltriraju tumor su značajno obogaćene 1-metilnikotinamidom (MNA). Iako je nivo MNA u T ćelijama povišen, ekspresija nikotinamid N-metiltransferaze (enzima koji katalizira prijenos metilnih grupa sa S-adenozilmetionina na nikotinamid) ograničena je na fibroblaste i tumorske ćelije. Funkcionalno, MNA inducira T ćelije da luče citokin tumorske nekroze alfa koji potiče rast tumora. Stoga, MNA izveden iz TME doprinosi imunološkoj regulaciji T ćelija i predstavlja potencijalnu metu imunoterapije za liječenje raka kod ljudi.
Metaboliti izvedeni iz tumora mogu imati snažan inhibitorni učinak na antitumorski imunitet, a sve više dokaza pokazuje da oni također mogu poslužiti kao ključna pokretačka snaga za progresiju bolesti (1). Pored Warburgovog efekta, nedavni radovi su započeli karakterizaciju metaboličkog stanja tumorskih ćelija i njegovog odnosa s imunološkim stanjem tumorskog mikrookruženja (TME). Studije na mišjim modelima i ljudskim T ćelijama pokazale su da metabolizam glutamina (2), oksidativni metabolizam (3) i metabolizam glukoze (4) mogu djelovati nezavisno na različite podgrupe imunoloških ćelija. Nekoliko metabolita u ovim putevima inhibira antitumorsku funkciju T ćelija. Dokazano je da blokada koenzima tetrahidrobiopterina (BH4) može oštetiti proliferaciju T ćelija, a povećanje BH4 u tijelu može pojačati antitumorski imunološki odgovor posredovan CD4 i CD8. Osim toga, imunosupresivni učinak kinurenina može se spasiti primjenom BH4 (5). Kod glioblastoma s izocitrat dehidrogenazom (IDH), sekrecija enantiometaboličkog (R)-2-hidroksiglutarata (R-2-HG) inhibira aktivaciju, proliferaciju i citolizu T ćelija (6). Nedavno je pokazano da metilglioksal, nusprodukt glikolize, proizvode supresorske ćelije mijeloidnog porijekla, a transfer metilglioksala putem T ćelija može inhibirati funkciju efektorskih T ćelija. U liječenju, neutralizacija metilglioksala može prevladati aktivnost supresorskih ćelija izvedenih iz mijeloida (MDSC) i sinergistički poboljšati terapiju blokade kontrolnih tačaka kod mišjih modela (7). Ove studije zajedno naglašavaju ključnu ulogu metabolita izvedenih iz TME u regulaciji funkcije i aktivnosti T ćelija.
Disfunkcija T ćelija je široko prijavljivana kod raka jajnika (8). To je dijelom zbog metaboličkih karakteristika svojstvenih hipoksiji i abnormalnoj vaskulaturi tumora (9), što rezultira konverzijom glukoze i triptofana u nusprodukte poput mliječne kiseline i kinurenina. Prekomjerni ekstracelularni laktat smanjuje proizvodnju interferona-γ (IFN-γ) i pokreće diferencijaciju mijelosupresivnih podgrupa (10, 11). Konzumacija triptofana direktno inhibira proliferaciju T ćelija i inhibira signalizaciju T ćelijskih receptora (12-14). Uprkos ovim zapažanjima, mnogo rada koji se odnosi na imunološki metabolizam provedeno je u in vitro kulturi T ćelija korištenjem optimiziranih medija ili ograničeno na homologne mišje modele in vivo, od kojih nijedan u potpunosti ne odražava heterogenost ljudskih karcinoma i fiziološkog makro i mikro okruženja.
Uobičajena karakteristika raka jajnika je peritonealno širenje i pojava ascitesa. Akumulacija ćelijske tečnosti u ascitesu povezana je s uznapredovalom bolešću i lošom prognozom (15). Prema izvještajima, ovaj jedinstveni odjeljak je hipoksičan, ima visoke nivoe faktora rasta vaskularnog endotela (VEGF) i indolamin 2,3-dioksigenaze (IDO), te je infiltriran T regulatornim ćelijama i mijeloidnim inhibitornim ćelijama (15-18). Metaboličko okruženje ascitesa može se razlikovati od samog tumora, tako da reprogramiranje T ćelija u peritonealnom prostoru nije jasno. Osim toga, ključne razlike i heterogenost između ascitesa i metabolita prisutnih u okruženju tumora mogu ometati infiltraciju imunih ćelija i njihovu funkciju na tumorima, te su potrebna daljnja istraživanja.
Kako bismo riješili ove probleme, osmislili smo osjetljivu metodu separacije ćelija i tečne hromatografije sa tandemskom masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) za proučavanje različitih tipova ćelija (uključujući CD4+ i CD8+ T ćelije), kao i unutar i između tumora. Njegovi metaboliti obuhvataju ćelije u istom ascitesu i tumorskom okruženju pacijenta. Ovu metodu koristimo u kombinaciji sa visokodimenzionalnom protočnom citometrijom i sekvenciranjem RNK pojedinačnih ćelija (scRNA-seq) kako bismo pružili visoko rezolutan portret metaboličkog statusa ovih ključnih populacija. Ova metoda je otkrila značajno povećanje nivoa 1-metilnikotinamida (MNA) u tumorskim T ćelijama, a in vitro eksperimenti su pokazali da imunomodulatorni efekat MNA na funkciju T ćelija ranije nije bio poznat. Općenito, ova metoda otkriva međusobne metaboličke interakcije između tumora i imunih ćelija i pruža jedinstven uvid u metabolite imunološke regulacije, što može biti korisno za liječenje raka jajnika imunoterapijom zasnovanom na T ćelijama. Mogućnosti liječenja.
Koristili smo visokodimenzionalnu protočnu citometriju kako bismo istovremeno kvantificirali unos glukoze [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiglukoza (2-NBDG) i mitohondrijalna aktivnost [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) su tipični markeri koji razlikuju imunološke ćelije i populacije tumorskih ćelija (Tabela S2 i Slika S1A). Ova analiza je pokazala da, u poređenju sa T ćelijama, ascites i tumorske ćelije imaju veće nivoe unosa glukoze, ali imaju manje razlike u mitohondrijskoj aktivnosti. Prosječan unos glukoze tumorskim ćelijama [CD45-EpCAM (EpCAM)+] je tri do četiri puta veći od T ćelija, a prosječan unos glukoze CD4+ T ćelija je 1,2 puta veći od CD8+ T ćelija, što ukazuje na to da tumor infiltrirajući limfociti (TIL) imaju različite metaboličke potrebe čak i u istom tumorskom epitelu (Slika 1A). Nasuprot tome, mitohondrijalna aktivnost u tumorskim ćelijama je slična onoj CD4+ T ćelija, a mitohondrijalna aktivnost oba tipa ćelija je veća od aktivnosti CD8+ T ćelija (Slika 1B). Općenito, ovi rezultati otkrivaju metabolički nivo. Metabolička aktivnost tumorskih ćelija je veća od aktivnosti CD4+ T ćelija, a metabolička aktivnost CD4+ T ćelija je veća od aktivnosti CD8+ T ćelija. Uprkos ovim efektima među tipovima ćelija, ne postoji konzistentna razlika u metaboličkom statusu CD4+ i CD8+ T ćelija ili njihovim relativnim udjelima u ascitesu u poređenju sa tumorima (Slika 1C). Nasuprot tome, u frakciji CD45-ćelija, udio EpCAM+ ćelija u tumoru se povećao u poređenju sa ascitesom (Slika 1D). Također smo uočili jasnu metaboličku razliku između EpCAM+ i EpCAM- ćelijskih komponenti. EpCAM+ (tumorske) ćelije imaju veću apsorpciju glukoze i mitohondrijsku aktivnost od EpCAM- ćelija, što je mnogo veće od metaboličke aktivnosti fibroblasta u tumorskim ćelijama kod tumorskog melanocitnog tumora (Slika 1, E i F).
(A i B) Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) unosa glukoze (2-NBDG) (A) i mitohondrijska aktivnost CD4+ T ćelija (MitoTracker tamnocrvena) (B) Reprezentativni grafikoni (lijevo) i tabelarni podaci (desno), CD8+ T ćelije i EpCAM+ CD45-tumorske ćelije iz ascitesa i tumora. (C) Odnos CD4+ i CD8+ ćelija (CD3+ T ćelija) u ascitesu i tumoru. (D) Udio EpCAM+ tumorskih ćelija u ascitesu i tumoru (CD45−). (E i F) EpCAM+ CD45-tumor i EpCAM-CD45-matriksna apsorpcija glukoze (2-NBDG) (E) i mitohondrijska aktivnost (MitoTracker tamnocrvena) (F) reprezentativni grafikoni (lijevo) i tabelarni podaci (desno) Ascites i tumorske ćelije. (G) Reprezentativni grafikoni ekspresije CD25, CD137 i PD1 protočnom citometrijom. (H i I) Ekspresija CD25, CD137 i PD1 na CD4+ T ćelijama (H) i CD8+ T ćelijama (I). (J i K) Naivni, centralno-memorijski (Tcm), efektorski (Teff) i efektorski memorijski (Tem) fenotipovi zasnovani na ekspresiji CCR7 i CD45RO. Reprezentativne slike (lijevo) i tabelarni podaci (desno) CD4+ T ćelija (J) i CD8+ T ćelija (K) u ascitesu i tumorima. P vrijednosti određene parnim t-testom (*P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001). Linija predstavlja uparene pacijente (n = 6). FMO, fluorescencija minus jedan; MFI, srednji intenzitet fluorescencije.
Daljnja analiza otkrila je druge značajne razlike između fenotipskog statusa visoko razlučenih T ćelija. Aktivirana (Slika 1, G do I) i efektorska memorija (Slika 1, J i K) u tumorima su mnogo češća od ascitesa (udio CD3+ T ćelija). Slično tome, analiza fenotipa ekspresijom aktivacijskih markera (CD25 i CD137) i markera deplecije [protein programirane ćelijske smrti 1 (PD1)] pokazala je da, iako su metaboličke karakteristike ovih populacija različite (Slika S1, B do E), nisu dosljedno uočene značajne metaboličke razlike između naivnih, efektorskih ili memorijskih podskupova (Slika S1, F do I). Ovi rezultati su potvrđeni korištenjem metoda mašinskog učenja za automatsko dodjeljivanje ćelijskih fenotipova (21), što je dodatno otkrilo prisustvo velikog broja ćelija koštane srži (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) u ascitesu pacijenta (Slika S2A). Među svim identifikovanim tipovima ćelija, ova populacija mijeloidnih ćelija pokazala je najveću apsorpciju glukoze i mitohondrijsku aktivnost (Slika S2, B do G). Ovi rezultati ističu snažne metaboličke razlike između više tipova ćelija pronađenih u ascitesu i tumorima kod pacijenata sa HGSC.
Glavni izazov u razumijevanju metabonomskih karakteristika TIL-a je potreba za izolacijom uzoraka T ćelija dovoljne čistoće, kvaliteta i količine iz tumora. Nedavne studije su pokazale da metode sortiranja i obogaćivanja kuglicama zasnovane na protočnoj citometriji mogu dovesti do promjena u profilima ćelijskih metabolita (22-24). Da bismo prevazišli ovaj problem, optimizirali smo metodu obogaćivanja kuglicama kako bismo izolovali i izolovali TIL iz hirurški reseciranog humanog raka jajnika prije analize LC-MS/MS (vidi Materijali i metode; Slika 2A). Kako bismo procijenili ukupni uticaj ovog protokola na promjene metabolita, uporedili smo profile metabolita T ćelija aktiviranih od strane zdravih donora nakon gore navedenog koraka odvajanja kuglica sa ćelijama koje nisu odvojene kuglicama, već su ostale na ledu. Ova analiza kontrole kvaliteta otkrila je da postoji visoka korelacija između ova dva uslova (r = 0,77), a tehnička ponovljivost grupe od 86 metabolita ima visoku ponovljivost (Slika 2B). Stoga, ove metode mogu izvršiti tačnu analizu metabolita u ćelijama koje prolaze kroz obogaćivanje ćelijskog tipa, pružajući tako prvu platformu visoke rezolucije za identifikaciju specifičnih metabolita u HGSC, omogućavajući ljudima da steknu dublje razumijevanje specifičnosti ćelijskog programa seksualnog metabolizma.
(A) Shematski dijagram obogaćivanja magnetskim kuglicama. Prije analize LC-MS/MS, ćelije će proći tri uzastopna kruga obogaćivanja magnetskim kuglicama ili će ostati na ledu. (B) Učinak tipa obogaćivanja na količinu metabolita. Prosjek tri mjerenja za svaki tip obogaćivanja ± SE. Siva linija predstavlja odnos 1:1. Intra-klasna korelacija (ICC) ponovljenih mjerenja prikazana je u oznaci ose. NAD, nikotinamid adenin dinukleotid. (C) Shematski dijagram toka rada analize metabolita pacijenta. Ascitesi ili tumori se prikupljaju od pacijenata i krioprezerviraju. Mali dio svakog uzorka analiziran je protočnom citometrijom, dok su preostali uzorci prošli tri kruga obogaćivanja za CD4+, CD8+ i CD45- ćelije. Ove ćelijske frakcije su analizirane pomoću LC-MS/MS. (D) Toplotna mapa standardizovane količine metabolita. Dendrogram predstavlja Wardovo grupisanje euklidskih udaljenosti između uzoraka. (E) Analiza glavnih komponenti (PCA) mape metabolita uzorka, koja prikazuje tri replikata svakog uzorka, uzorci istog pacijenta povezani su linijom. (F) PCA profila metabolita uzorka uvjetovanog pacijentom (tj. korištenjem djelomične redundancije); tip uzorka je ograničen konveksnom ljuskom. PC1, glavna komponenta 1; PC2, glavna komponenta 2.
Zatim smo primijenili ovu metodu obogaćivanja kako bismo analizirali 99 metabolita u frakcijama CD4+, CD8+ i CD45-ćelija u primarnom ascitesu i tumorima šest pacijenata sa HGSC (Slika 2C, Slika S3A i Tabela S3 i S4). Populacija od interesa čini 2% do 70% originalnog velikog uzorka živih ćelija, a udio ćelija uveliko varira između pacijenata. Nakon odvajanja kuglica, obogaćena frakcija od interesa (CD4+, CD8+ ili CD45-) čini u prosjeku više od 85% svih živih ćelija u uzorku. Ova metoda obogaćivanja nam omogućava da analiziramo populacije ćelija iz metabolizma ljudskog tumorskog tkiva, što je nemoguće učiniti iz velikih uzoraka. Koristeći ovaj protokol, utvrdili smo da su l-kinurenin i adenozin, ova dva dobro okarakterisana imunosupresivna metabolita, povišeni u tumorskim T ćelijama ili tumorskim ćelijama (Slika S3, B i C). Stoga, ovi rezultati pokazuju pouzdanost i sposobnost naše tehnologije separacije ćelija i masene spektrometrije da pronađe biološki važne metabolite u tkivima pacijenata.
Naša analiza je također otkrila snažnu metaboličku separaciju tipova ćelija unutar i između pacijenata (Slika 2D i Slika S4A). Posebno, u poređenju s drugim pacijentima, pacijent 70 je pokazao drugačije metaboličke karakteristike (Slika 2E i Slika S4B), što ukazuje na to da može postojati značajna metabolička heterogenost između pacijenata. Vrijedi napomenuti da je, u poređenju s drugim pacijentima (1,2 do 2 litra; Tabela S1), ukupna količina prikupljenog ascitesa kod pacijenta 70 (80 ml) bila manja. Kontrola heterogenosti između pacijenata tokom analize glavnih komponenti (na primjer, korištenjem analize parcijalne redundancije) pokazuje konzistentne promjene između tipova ćelija, a tipovi ćelija i/ili mikrookruženje su jasno agregirani prema profilu metabolita (Slika 2F). Analiza pojedinačnih metabolita naglasila je ove efekte i otkrila značajne razlike između tipova ćelija i mikrookruženja. Vrijedi napomenuti da je najekstremnija uočena razlika MNA, koja je obično obogaćena CD45- ćelijama i CD4+ i CD8+ ćelijama koje infiltriraju tumor (Slika 3A). Za CD4+ ćelije, ovaj efekat je najočigledniji, a čini se da je i okolina snažno uticala na MNA u CD8+ ćelijama. Međutim, to nije važno, jer se samo tri od šest pacijenata mogu procijeniti na CD8+ rezultate tumora. Pored MNA, u različitim tipovima ćelija u ascitesu i tumorima, i drugi metaboliti koji su slabo okarakterisani u TIL-u su različito bogati (Slike S3 i S4). Stoga, ovi podaci otkrivaju obećavajući skup imunomodulatornih metabolita za dalja istraživanja.
(A) Normalizovani sadržaj MNA u CD4+, CD8+ i CD45- ćelijama iz ascitesa i tumora. Box plot prikazuje medijanu (linija), interkvartilni raspon (okvirni zglob) i raspon podataka, do 1,5 puta veći od interkvartilnog raspona (okvirni brkovi). Kao što je opisano u Materijalima i metodama za pacijente, koristite pacijentovu limma vrijednost za određivanje P vrijednosti (*P<0,05 i **P<0,01). (B) Shematski dijagram metabolizma MNA (60). Metaboliti: S-adenozil-1-metionin; SAH, S-adenozin-1-homocistein; NA, nikotinamid; MNA, 1-metilnikotinamid; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamid; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamid; NR, nikotinamid riboza; NMN, nikotinamid mononukleotid. Enzimi (zeleno): NNMT, nikotinamid N-metiltransferaza; SIRT, sirtuini; NAMPT, nikotinamid fosforibozil transferaza; AOX1, aldehid oksidaza 1; NRK, nikotinamid ribozid kinaza; NMNAT, nikotinamid mononukleotid adenilat transferaza; Pnp1, purin nukleozid fosforilaza. (C) t-SNE scRNA-sekvenciranja ascitesa (sivo) i tumora (crveno; n = 3 pacijenta). (D) Ekspresija NNMT u različitim ćelijskim populacijama identifikovanim korištenjem scRNA-sekvenciranja. (E) Ekspresija NNMT i AOX1 u SK-OV-3, humanom embrionalnom bubregu (HEK) 293T, T ćelijama i MNA-tretiranim T ćelijama. Prikazana je presavijena ekspresija u odnosu na SK-OV-3. Prikazan je obrazac ekspresije sa SEM (n = 6 zdravih donora). Ct vrijednosti veće od 35 smatraju se nedetektabilnim (UD). (F) Ekspresija SLC22A1 i SLC22A2 u SK-OV-3, HEK293T, T ćelijama i T ćelijama tretiranim sa 8mM MNA. Prikazana je presavijena ekspresija u odnosu na SK-OV-3. Prikazan je obrazac ekspresije sa SEM (n = 6 zdravih donora). Vrijednosti Ct veće od 35 smatraju se nedetektabilnim (UD). (G) Sadržaj ćelijskog MNA u aktiviranim zdravim T ćelijama donora nakon 72 sata inkubacije sa MNA. Prikazan je obrazac ekspresije sa SEM (n = 4 zdrava donora).
MNA se proizvodi prenosom metil grupe sa S-adenozil-1-metionina (SAM) na nikotinamid (NA) putem nikotinamid N-metiltransferaze (NNMT; Slika 3B). NNMT je prekomjerno eksprimiran u raznim ljudskim karcinomima i povezan je sa proliferacijom, invazijom i metastazama (25-27). Da bismo bolje razumjeli izvor MNA u T ćelijama kod TME, koristili smo scRNA-seq za karakterizaciju ekspresije NNMT u različitim tipovima ćelija u ascitesu i tumorima tri pacijenta sa HGSC (Tabela S5). Analiza približno 6.500 ćelija pokazala je da je u ascitesu i tumorskom okruženju ekspresija NNMT bila ograničena na pretpostavljene populacije fibroblasta i tumorskih ćelija (Slika 3, C i D). Vrijedi napomenuti da ne postoji očigledna ekspresija NNMT ni u jednoj populaciji koja eksprimira PTPRC (CD45+) (Slika 3D i Slika S5A), što ukazuje na to da je MNA detektovan u spektru metabolita uveden u T ćelije. Ekspresija aldehid oksidaze 1 (AOX1) pretvara MNA u 1-metil-2-piridon-5-karboksamid (2-PYR) ili 1-metil-4-piridon-5-karboksamid (4-PYR); Slika 3B) je također ograničena na populaciju fibroblasta koji eksprimiraju COL1A1 (Slika S5A), što zajedno ukazuje na to da T ćelije nemaju sposobnost konvencionalnog metabolizma MNA. Obrazac ekspresije ovih gena povezanih s MNA potvrđen je korištenjem drugog nezavisnog skupa podataka o ćelijama ascitesa pacijenata s HGSC (Slika S5B; n = 6) (16). Osim toga, kvantitativna analiza lančane reakcije polimeraze (qPCR) zdravih donorskih T ćelija tretiranih MNA pokazala je da, u poređenju s kontrolnim SK-OV-3 ćelijama tumora jajnika, NNMT ili AOX1 gotovo nisu eksprimirani (Slika 3E). Ovi neočekivani rezultati ukazuju na to da se MNA može lučiti iz fibroblasta ili tumora u susjedne T ćelije kod TME.
Iako kandidati uključuju porodicu organskih kationskih transportera 1 do 3 (OCT1, OCT2 i OCT3) kodiranih porodicom rastvorljivih nosača 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 i SLC22A3), potencijalni transporteri MNA još uvijek nisu definirani (28). QPCR mRNA iz zdravih donorskih T ćelija pokazao je niske nivoe ekspresije SLC22A1, ali nedetektabilne nivoe SLC22A2, što je potvrdilo da je to prethodno zabilježeno u literaturi (Slika 3F) (29). Nasuprot tome, ćelijska linija tumora jajnika SK-OV-3 eksprimirala je visoke nivoe oba transportera (Slika 3F).
Kako bi se testirala mogućnost da T ćelije imaju sposobnost apsorpcije stranog MNA, zdrave donorske T ćelije su kultivirane 72 sata u prisustvu različitih koncentracija MNA. U odsustvu egzogenog MNA, ćelijski sadržaj MNA se ne može detektovati (Slika 3G). Međutim, aktivirane T ćelije tretirane egzogenim MNA pokazale su povećanje sadržaja MNA u ćelijama zavisno od doze, do 6 mM MNA (Slika 3G). Ovaj rezultat ukazuje da uprkos niskom nivou ekspresije transportera i nedostatku glavnog enzima odgovornog za intracelularni metabolizam MNA, TIL i dalje može apsorbovati MNA.
Spektar metabolita u T ćelijama pacijenata i in vitro eksperimenti apsorpcije MNA povećavaju mogućnost da fibroblasti povezani s rakom (CAF) luče MNA i da tumorske ćelije mogu regulirati fenotip i funkciju TIL-a. Da bi se utvrdio učinak MNA na T ćelije, zdrave donorske T ćelije su aktivirane in vitro u prisustvu ili odsustvu MNA, a njihova proliferacija i proizvodnja citokina su procijenjene. Nakon 7 dana dodavanja MNA u najvećoj dozi, broj udvostručenja populacije je umjereno smanjen, dok je vigor održan pri svim dozama (Slika 4A). Osim toga, tretman egzogenim MNA rezultirao je povećanjem udjela CD4+ i CD8+ T ćelija koje eksprimiraju faktor tumorske nekroze-α (TNFα; Slika 4B). Nasuprot tome, intracelularna proizvodnja IFN-γ je značajno smanjena u CD4+ T ćelijama, ali ne i u CD8+ T ćelijama, i nije bilo značajne promjene u interleukinu 2 (IL-2; Slika 4, C i D). Stoga je enzimsko-vezani imunosorbentni test (ELISA) supernatanata iz ovih MNA-tretiranih T ćelijskih kultura pokazao značajno povećanje TNFα, smanjenje IFN-γ i bez promjene IL-2 (Slika 4, E do G). Smanjenje IFN-γ ukazuje na to da MNA može igrati ulogu u inhibiranju antitumorske aktivnosti T ćelija. Kako bi se simulirao učinak MNA na citotoksičnost posredovanu T ćelijama, himerne antigenske receptorske T (FRα-CAR-T) ćelije koje ciljaju folatni receptor α i CAR-T (GFP) regulirane zelenim fluorescentnim proteinom (GFP) -CAR-T) ćelije proizvode se od strane zdravih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) donora. CAR-T ćelije su kultivirane 24 sata u prisustvu MNA, a zatim su kokultivirane sa ljudskim SK-OV-3 tumorskim ćelijama jajnika koje eksprimiraju folatni receptor α u omjeru efektora i cilja od 10:1. Tretman MNA rezultirao je značajnim smanjenjem aktivnosti ubijanja FRα-CAR-T ćelija, što je bilo slično FRα-CAR-T ćelijama tretiranim adenozinom (Slika 4H).
(A) Ukupan broj održivih ćelija i udvostručenje populacije (PD) direktno iz kulture 7. dana. Trakasti grafikon predstavlja srednju vrijednost + SEM šest zdravih donora. Predstavlja podatke iz najmanje n = 3 nezavisna eksperimenta. (B do D) CD3/CD28 i IL-2 su korišteni za aktiviranje T ćelija pri njihovim odgovarajućim koncentracijama MNA tokom 7 dana. Prije analize, ćelije su stimulisane sa PMA/ionomicinom sa GolgiStopom tokom 4 sata. Ekspresija TNFα (B) u T ćelijama. Primjer slike (lijevo) i tabelarni podaci (desno) ekspresije TNFα u živim ćelijama. Ekspresija IFN-γ (C) i IL-2 (D) u T ćelijama. Ekspresija citokina je mjerena protočnom citometrijom. Trakasti grafikon predstavlja srednju vrijednost (n = 6 zdravih donora) + SEM. Koristite jednosmjernu analizu varijanse i ponovljena mjerenja (*P<0,05 i **P<0,01) da biste odredili P vrijednost. Predstavlja podatke iz najmanje n = 3 nezavisna eksperimenta. (E do G) CD3/CD28 i IL-2 su korišteni za aktivaciju T ćelija pri njihovim odgovarajućim koncentracijama MNA tokom 7 dana. Medij je sakupljen prije i nakon 4 sata stimulacije PMA/ionomicinom. Koncentracije TNFα (E), IFN-γ (F) i IL-2 (G) su mjerene ELISA testom. Stupčasti grafikon predstavlja srednju vrijednost (n = 5 zdravih donora) + SEM. P vrijednost je određena korištenjem jednosmjerne analize varijanse i ponovljenih mjerenja (*P<0,05). Isprekidana linija označava granicu detekcije. (H) Test lize ćelija. FRα-CAR-T ili GFP-CAR-T ćelije su podešene adenozinom (250μM) ili MNA (10 mM) tokom 24 sata ili su ostavljene netretirane (Ctrl). Procenat ubijanja SK-OV-3 ćelija je mjeren. P vrijednost je određena Welch t testom (*P<0,5 i **P<0,01).
Kako bi se steklo mehanističko razumijevanje regulacije ekspresije TNFα zavisne od MNA, procijenjene su promjene u TNFα mRNA T ćelija tretiranih MNA (Slika 5A). Zdrave donorske T ćelije tretirane sa MNA pokazale su dvostruko povećanje nivoa transkripcije TNFα, što ukazuje na to da je MNA zavisan od transkripcijske regulacije TNFα. Da bi se istražio ovaj mogući regulatorni mehanizam, dva poznata transkripcijska faktora koji regulišu TNFα, naime aktivirani nuklearni faktor T ćelija (NFAT) i specifični protein 1 (Sp1), procijenjeni su kao odgovor na vezivanje MNA za proksimalni TNFα promotor (30). TNFα promotor sadrži 6 identifikovanih mjesta vezivanja NFAT-a i 2 mjesta vezivanja Sp1, koja se preklapaju na jednom mjestu [-55 baznih parova (bp) od 5' kape] (30). Imunoprecipitacija hromatina (ChIP) pokazala je da se, kada se tretira sa MNA, vezivanje Sp1 za TNFα promotor povećalo tri puta. Ugradnja NFAT-a se također povećala i približila se važnosti (Slika 5B). Ovi podaci ukazuju na to da MNA reguliše ekspresiju TNFα putem transkripcije Sp1, a u manjoj mjeri i ekspresiju NFAT-a.
(A) U poređenju sa T ćelijama kultivisanim bez MNA, promjena ekspresije TNFα u T ćelijama tretiranim sa MNA je veća od 100% u odnosu na prethodnih. Prikazan je obrazac ekspresije sa SEM (n = 5 zdravih donora). Predstavlja podatke iz najmanje n = 3 nezavisna eksperimenta. (B) TNFα promotor T ćelija tretiranih sa ili bez 8 mM MNA nakon što su NFAT i Sp1 kombinovani sa (Ctrl) i PMA/ionomicin stimulacijom tokom 4 sata. Imunoglobulin G (IgG) i H3 su korišteni kao negativne i pozitivne kontrole za imunoprecipitaciju. Kvantifikacija ChIP-a pokazala je da se vezivanje Sp1 i NFAT-a za TNFα promotor u ćelijama tretiranim MNA povećalo nekoliko puta u poređenju sa kontrolom. Predstavlja podatke iz najmanje n = 3 nezavisna eksperimenta. P vrijednost određena višestrukim t-testovima (*** P <0,01). (C) U poređenju sa ascitesom HGSC, T ćelije (necitotoksične) su pokazale povećanu ekspresiju TNF-a u tumoru. Boje predstavljaju različite pacijente. Prikazane ćelije su nasumično uzorkovane na 300 i podešane kako bi se ograničilo prekoračenje (** Padj = 0,0076). (D) Predloženi model MNA za rak jajnika. MNA se proizvodi u tumorskim ćelijama i fibroblastima u TME i preuzimaju ga T ćelije. MNA povećava vezivanje Sp1 za TNFα promotor, što dovodi do povećane transkripcije TNFα i proizvodnje TNFα citokina. MNA također uzrokuje smanjenje IFN-γ. Inhibicija funkcije T ćelija dovodi do smanjene sposobnosti ubijanja i ubrzanog rasta tumora.
Prema izvještajima, TNFα ima prednje i zadnje zavisne antitumorske i antitumorske efekte, ali ima dobro poznatu ulogu u promovisanju rasta i metastaza raka jajnika (31-33). Prema izvještajima, koncentracija TNFα u ascitesu i tumorskom tkivu kod pacijenata sa rakom jajnika je veća nego u benignim tkivima (34-36). Što se tiče mehanizma, TNFα može regulisati aktivaciju, funkciju i proliferaciju bijelih krvnih zrnaca i promijeniti fenotip ćelija raka (37, 38). U skladu sa ovim nalazima, analiza diferencijalne ekspresije gena pokazala je da je TNF značajno pojačan u T ćelijama u tumorskom tkivu u poređenju sa ascitesom (Slika 5C). Povećanje ekspresije TNF bilo je evidentno samo u populacijama T ćelija sa necitotoksičnim fenotipom (Slika S5A). Ukratko, ovi podaci podržavaju stav da MNA ima dvostruke imunosupresivne i tumor promotivne efekte kod HGSC.
Fluorescentno označavanje zasnovano na protočnoj citometriji postalo je glavna metoda za proučavanje metabolizma TIL-a. Ove studije su pokazale da, u poređenju sa limfocitima periferne krvi ili T ćelijama iz sekundarnih limfoidnih organa, mišji i ljudski TIL imaju veću tendenciju ka apsorpciji glukoze (4, 39) i postepenom gubitku mitohondrijalne funkcije (19, 40). Iako smo u ovoj studiji uočili slične rezultate, ključni razvoj je poređenje metabolizma tumorskih ćelija i TIL-a iz istog reseciranog tumorskog tkiva. U skladu sa nekim od ovih prethodnih izvještaja, tumorske (CD45-EpCAM+) ćelije iz ascitesa i tumora imaju veću apsorpciju glukoze od CD8+ i CD4+ T ćelija, što podržava tvrdnju da se visoka apsorpcija glukoze tumorskih ćelija može uporediti sa T ćelijama. Koncept konkurencije T ćelija. TME. Međutim, mitohondrijska aktivnost tumorskih ćelija je veća od aktivnosti CD8+ T ćelija, ali je mitohondrijska aktivnost slična aktivnosti CD4+ T ćelija. Ovi rezultati pojačavaju novu temu da je oksidativni metabolizam važan za tumorske ćelije (41, 42). Oni također sugeriraju da CD8+ T ćelije mogu biti podložnije oksidativnoj disfunkciji od CD4+ T ćelija ili da CD4+ T ćelije mogu koristiti izvore ugljika osim glukoze za održavanje mitohondrijalne aktivnosti (43, 44). Treba napomenuti da nismo uočili razliku u unosu glukoze ili mitohondrijalnoj aktivnosti između CD4+ T efektora, T efektorskih memorijskih i T centralnih memorijskih ćelija u ascitesu. Slično tome, stanje diferencijacije CD8+ T ćelija u tumorima nema nikakve veze s promjenama u unosu glukoze, što ističe značajnu razliku između T ćelija kultiviranih in vitro i humanog TIL-a in vivo (22). Ova zapažanja su također potvrđena korištenjem nepristrasne automatske alokacije ćelijske populacije, koja je dalje otkrila da su CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ ćelije s većim unosom glukoze i mitohondrijskom aktivnošću od tumorskih ćelija preovlađujuće, ali imaju metabolički aktivnu ćelijsku populaciju. Ova populacija može predstavljati pretpostavljenu subpopulaciju mijeloidnih supresorskih ćelija ili plazmacitoidnih dendritičnih ćelija identificiranih u scRNA-seq analizi. Iako su oba ova slučaja zabilježena kod tumora jajnika kod ljudi [45], i dalje je potrebno dalje istraživanje kako bi se opisala ova mijeloidna subpopulacija.
Iako metode zasnovane na protočnoj citometriji mogu razjasniti opće razlike u metabolizmu glukoze i oksidativnom metabolizmu između tipova ćelija, precizni metaboliti koje proizvodi glukoza ili drugi izvori ugljika za mitohondrijski metabolizam u TME još nisu određeni. Dodjeljivanje prisustva ili odsustva metabolita datoj TIL podskupini zahtijeva prečišćavanje ćelijske populacije iz izrezanog tkiva. Stoga, naša metoda obogaćivanja ćelija u kombinaciji sa masenom spektrometrijom može pružiti uvid u metabolite koji su različito obogaćeni u T ćelijama i populacijama tumorskih ćelija u odgovarajućim uzorcima pacijenata. Iako ova metoda ima prednosti u odnosu na sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom, određene biblioteke metabolita mogu biti pogođene zbog inherentne stabilnosti i/ili brze brzine prometa (22). Ipak, naša metoda je bila u stanju identificirati dva prepoznata imunosupresivna metabolita, adenozin i kinurenin, jer se oni uveliko razlikuju između tipova uzoraka.
Naša metabonomska analiza tumora i TIL podtipova pruža više uvida u ulogu metabolita u TME jajnika. Prvo, korištenjem protočne citometrije utvrdili smo da nema razlike u mitohondrijskoj aktivnosti između tumora i CD4+ T ćelija. Međutim, LC-MS/MS analiza otkrila je značajne promjene u količini metabolita među ovim populacijama, što ukazuje na to da zaključci o metabolizmu TIL-a i njegovoj ukupnoj metaboličkoj aktivnosti zahtijevaju pažljivo tumačenje. Drugo, MNA je metabolit s najvećom razlikom između CD45-ćelija i T ćelija u ascitesu, a ne u tumorima. Stoga, kompartmentalizacija i lokacija tumora mogu imati različite efekte na metabolizam TIL-a, što naglašava moguću heterogenost u datom mikrookruženju. Treće, ekspresija enzima NNMT koji proizvodi MNA uglavnom je ograničena na CAF, što je u manjoj mjeri tumorske ćelije, ali detektabilni nivoi MNA su uočeni u T ćelijama izvedenim iz tumora. Prekomjerna ekspresija NNMT u CAF jajnika ima poznati efekat koji podstiče rak, dijelom zbog promocije metabolizma CAF, invazije tumora i metastaza (27). Iako je ukupni nivo TIL-a umjeren, ekspresija NNMT-a u CAF-u je usko povezana s mezenhimalnim podtipom Atlasa genoma raka (TCGA), koji je povezan s lošom prognozom (27, 46, 47). Konačno, ekspresija enzima AOX1 odgovornog za degradaciju MNA također je ograničena na populaciju CAF-a, što ukazuje na to da T ćelije nemaju sposobnost metaboliziranja MNA. Ovi rezultati podržavaju ideju da, iako je potrebno daljnje istraživanje kako bi se potvrdio ovaj nalaz, visoki nivoi MNA u T ćelijama mogu ukazivati ​​na prisustvo imunosupresivnog mikrookruženja CAF-a.
S obzirom na nizak nivo ekspresije MNA transportera i nedetektabilne nivoe ključnih proteina uključenih u metabolizam MNA, prisustvo MNA u T ćelijama je neočekivano. Ni NNMT ni AOX1 nisu mogli biti detektovani scRNA-seq analizom i ciljanom qPCR analizom dvije nezavisne kohorte. Ovi rezultati ukazuju na to da MNA ne sintetiziraju T ćelije, već se apsorbira iz okolnog TME. In vitro eksperimenti pokazuju da T ćelije imaju tendenciju akumuliranja egzogenog MNA.
Naše in vitro studije su pokazale da egzogeni MNA indukuje ekspresiju TNFα u T ćelijama i pojačava vezivanje Sp1 za TNFα promotor. Iako TNFα ima i antitumorske i antitumorske funkcije, kod raka jajnika, TNFα može promovisati rast raka jajnika (31-33). Neutralizacija TNFα u kulturi tumorskih ćelija jajnika ili eliminacija TNFα signala u mišjim modelima može poboljšati proizvodnju inflamatornih citokina posredovanih TNFα i inhibirati rast tumora (32, 35). Stoga, u ovom slučaju, MNA izveden iz TME može djelovati kao proinflamatorni metabolit putem TNFα-zavisnog mehanizma kroz autokrinu petlju, čime se podstiče pojava i širenje raka jajnika (31). Na osnovu ove mogućnosti, blokada TNFα se proučava kao potencijalno terapijsko sredstvo za rak jajnika (37, 48, 49). Pored toga, MNA smanjuje citotoksičnost CAR-T ćelija na tumorske ćelije jajnika, pružajući dalje dokaze za imunosupresiju posredovanu MNA. Zajedno, ovi rezultati sugerišu model u kojem tumori i CAF ćelije luče MNA u ekstracelularni TME. Kroz (i) stimulaciju rasta raka jajnika izazvanu TNF-om i (ii) inhibiciju citotoksične aktivnosti T ćelija izazvanu MNA-om, ovo može imati dvostruki tumorski efekat (Slika 5D).
Zaključno, primjenom kombinacije brzog obogaćivanja ćelija, sekvenciranja pojedinačnih ćelija i metaboličkog profiliranja, ova studija je otkrila ogromne imunometabolomske razlike između tumorskih i ascites ćelija kod pacijenata sa HGSC. Ova sveobuhvatna analiza pokazala je da postoje razlike u unosu glukoze i mitohondrijskoj aktivnosti između T ćelija, te je identificirala MNA kao nećelijski autonomni imunološki regulatorni metabolit. Ovi podaci utiču na to kako TME utiče na metabolizam T ćelija kod ljudskih karcinoma. Iako je zabilježena direktna konkurencija za hranjive tvari između T ćelija i ćelija raka, metaboliti također mogu djelovati kao indirektni regulatori koji podstiču progresiju tumora i moguće suzbijaju endogene imunološke odgovore. Daljnji opis funkcionalne uloge ovih regulatornih metabolita mogao bi otvoriti alternativne strategije za poboljšanje antitumorskog imunološkog odgovora.
Uzorci pacijenata i klinički podaci prikupljeni su putem repozitorija tkiva tumora raka dojke, certificiranog od strane Kanadske mreže repozitorija tkiva. Prema protokolu koji su odobrili Etički komitet za istraživanje raka dojke i Univerzitet Britanske Kolumbije (H07-00463), svi uzorci i klinički podaci pacijenata dobili su informirani pisani pristanak ili su formalno odrekli pristanka. Uzorci se čuvaju u certificiranoj BioBank banci (BRC-00290). Detaljne karakteristike pacijenata prikazane su u tabelama S1 i S5. Za krioprezervaciju, skalpel se koristi za mehaničko razlaganje uzorka tumora pacijenta, a zatim se propušta kroz filter od 100 mikrona kako bi se dobila suspenzija pojedinačnih ćelija. Pacijentov ascites je centrifugiran na 1500 o/min tokom 10 minuta na 4°C kako bi se ćelije taložile i uklonio supernatant. Ćelije dobijene iz tumora i ascitesa su krioprezervirane u 50% toplotno inaktiviranom humanom AB serumu (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) i 10% dimetil sulfoksidu. Ove konzervirane suspenzije pojedinačnih ćelija su odmrznute i korištene za metabolomiku i određivanje metabolita opisano u nastavku.
Kompletan medij se sastoji od 0,22 μm filtriranog 50:50 RPMI 1640:AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) dopunjenog sa 10% toplinski inaktiviranog humanog AB seruma (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x rastvora penicilina i streptomicina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) i 50 μMB-merkaptoetanola. AimV (Invitrogen) je dopunjen sa 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) i 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific). Pufer za bojenje protočnog citometra sastojao se od 0,22 μm filtrirane fosfatno puferirane fiziološke otopine (PBS; Invitrogen) dopunjene sa 3% toplinski inaktiviranog AB humanog seruma (Sigma). Pufer za obogaćivanje ćelija sastoji se od 0,22 μm filtriranog PBS-a i dopunjenog sa 0,5% toplotno inaktiviranog humanog AB seruma (Sigma-Aldrich).
U kompletnom mediju na 37°C, ćelije su obojene sa 10 nM MT DR i 100 μM 2-NBDG tokom 30 minuta. Zatim su ćelije obojene bojom za održivost eF506 na 4°C tokom 15 minuta. Resuspendujte ćelije u FC Block (eBioscience) i Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), razrijedite u puferu za bojenje protočne citometrije (prema uputama proizvođača) i inkubirajte 10 minuta na sobnoj temperaturi. Obojite ćelije setom antitijela (Tabela S2) u puferu za bojenje protočne citometrije na 4°C tokom 20 minuta. Resuspendujte ćelije u puferu za bojenje protočne citometrije (Cytek Aurora; konfiguracija 3L-16V-14B-8R) prije analize. Koristite SpectroFlo i FlowJo V10 za analizu podataka o broju ćelija i koristite GraphPad Prism 8 za kreiranje podataka. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) 2-NBDG i MT DR je logaritamski normalizovan, a zatim je za statističku analizu korišten t-test za uparivanje kako bi se uzeli u obzir upareni pacijenti. Uklonite iz analize sve populacije sa manje od 40 događaja; unesite MFI vrijednost 1 za sve negativne vrijednosti prije izvođenja statističke analize i vizualizacije podataka.
Kako bismo dopunili strategiju ručnog usklađivanja gore navedenog procesnog panela, koristili smo punu anotaciju pomoću stabla ograničenja oblika (FAUST) (21) kako bismo automatski dodijelili ćelije populaciji nakon eliminacije mrtvih ćelija u FlowJo-u. Ručno upravljamo izlazom kako bismo spojili populacije koje izgledaju pogrešno raspoređene (kombinujući PD1+ sa PD1-tumorskim ćelijama) i zadržane populacije. Svaki uzorak sadrži u prosjeku više od 2% ćelija, za ukupno 11 populacija.
Centrifugiranje u gradijentu gustine Ficolla korišteno je za odvajanje PBMC od produkata separacije leukocita (STEMCELL Technologies). CD8+ T ćelije su izolovane iz PBMC korištenjem CD8 MicroBeads (Miltenyi) i ekspandirane u kompletnom mediju korištenjem TransAct (Miltenyi) tokom 2 sedmice prema uputama proizvođača. Ćelije su ostavljene da stoje 5 dana u kompletnom mediju koji sadrži IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), a zatim su ponovo stimulisane sa TransAct. Sedmog dana, prema uputama proizvođača, ljudske CD45 MicroBeads (Miltenyi) su korištene za obogaćivanje ćelija u tri uzastopna kruga. Ćelije su alikvotirane za analizu protočnom citometrijom (kao što je gore opisano), a milion ćelija je alikvotirano tri puta za LC-MS/MS analizu. Uzorci su obrađeni LC-MS/MS kao što je opisano u nastavku. Vrijednost nedostajućeg metabolita procijenili smo s ionskim brojem od 1.000. Svaki uzorak se normalizira ukupnim brojem iona (TIC), logaritamski pretvara i automatski normalizira u MetaboAnalystR-u prije analize.
Suspenzija pojedinačnih ćelija svakog pacijenta je odmrznuta i filtrirana kroz filter od 40 μm u kompletni medij (kao što je gore opisano). Prema protokolu proizvođača, tri uzastopna kruga pozitivne selekcije magnetskom separacijom kuglica korištenjem MicroBeads (Miltenyi) su korištena za obogaćivanje uzoraka za CD8+, CD4+ i CD45- ćelije (na ledu). Ukratko, ćelije su resuspendirane u puferu za obogaćivanje ćelija (kao što je gore opisano) i prebrojane. Ćelije su inkubirane sa humanim CD8 kuglicama, humanim CD4 kuglicama ili humanim CD45 kuglicama (Miltenyi) na 4°C tokom 15 minuta, a zatim isprane puferom za obogaćivanje ćelija. Uzorak se propušta kroz LS kolonu (Miltenyi), a pozitivne i negativne frakcije se sakupljaju. Kako bi se smanjilo trajanje i maksimizirao korak oporavka ćelija, CD8-frakcija se zatim koristi za drugi krug obogaćivanja CD4+, a CD4-frakcija se koristi za naknadno obogaćivanje CD45. Rastvor držite na ledu tokom cijelog procesa separacije.
Da bi se pripremili uzorci za analizu metabolita, ćelije su jednom isprane ledeno hladnim rastvorom soli, a svakom uzorku je dodat 1 ml 80% metanola, zatim su promiješane u vrtlogu i brzo zamrznute u tekućem dušiku. Uzorci su podvrgnuti tri ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja i centrifugirani pri 14.000 o/min tokom 15 minuta na 4°C. Supernatant koji sadrži metabolite je isparavan dok se ne osuši. Metaboliti su ponovo rastvoreni u 50 μl 0,03% mravlje kiseline, promiješani u vrtlogu da se pomiješaju, a zatim centrifugirani da se uklone ostaci.
Ekstrahujte metabolite kao što je gore opisano. Prebacite supernatant u bocu za tečnu hromatografiju visoke efikasnosti za metabolomska istraživanja. Koristite protokol slučajnog tretmana za tretiranje svakog uzorka sa sličnim brojem ćelija kako biste spriječili efekte serije. Izvršili smo kvalitativnu procjenu globalnih metabolita prethodno objavljenih na AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole masenom spektrometru (50). Kromatografska analiza i integracija površine vrha izvršene su korištenjem softvera MultiQuant verzije 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Za procjenu vrijednosti nedostajućeg metabolita korišten je broj iona od 1000, a TIC svakog uzorka korišten je za izračunavanje normalizirane površine vrha svakog detektovanog metabolita kako bi se korigovale promjene uvedene instrumentalnom analizom obrade uzorka. Nakon normalizacije TIC-a, MetaboAnalystR(51) (zadani parametar) koristi se za logaritamsku konverziju i automatsko skaliranje normativne linije. Koristili smo PCA s veganskim R paketom za istraživačku analizu razlika u metabolomima između tipova uzoraka i koristili smo analizu parcijalne redundancije za analizu pacijenata. Koristili smo Wardovu metodu za konstrukciju dendrograma toplotne mape kako bismo grupirali euklidsku udaljenost između uzoraka. Koristili smo limu (52) na standardiziranoj količini metabolita kako bismo identificirali različito obilne metabolite u cijelom tipu ćelija i mikrookruženju. Radi pojednostavljenja objašnjenja, koristimo parametar grupne sredine za određivanje modela i razmatramo tipove ćelija u mikrookruženju kao svaku grupu (n = 6 grupa); za test značajnosti izvršili smo tri ponovljena mjerenja za svaki metabolit. Kako bismo izbjegli lažnu replikaciju, pacijent je uključen kao prepreka u dizajn lime. Kako bismo provjerili razlike u metabolitima između različitih pacijenata, prilagodili smo model lime uključujući pacijente na fiksni način. Izvještavamo o značajnosti unaprijed određenog kontrasta između tipa ćelija i mikrookruženja Padj <0,05 (Benjamini-Hochbergova korekcija).
Nakon obogaćivanja vigorom korištenjem Miltenyi Dead Cell Removal Kit-a (>80% vijabilnosti), sekvenciranje transkriptoma pojedinačnih ćelija izvršeno je na ukupnim živim zamrznutim uzorcima ascitesa i tumora korištenjem 10x 5′ protokola ekspresije gena. Analizirano je pet slučajeva sa odgovarajućim tumorima i ascitesom, iako je niska vijabilnost jednog uzorka tumora spriječila njegovo uključivanje. Kako bismo postigli višestruki odabir pacijenata, kombinovali smo uzorke svakog pacijenta u trakama 10x hrom kontrolera i odvojeno analizirali mjesta ascitesa i tumora. Nakon sekvenciranja [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; prosječno 73.488 i 41.378 očitavanja po ćeliji za tumor i ascites, respektivno]], koristili smo CellSNP i Vireo (53) (bazirano na CellSNP kao [nedodijeljeno]). Uobičajenom ljudskom SNP-u (VCF) koji pruža GRCh38 dodijeljen je identitet donora. Koristimo SNPRelate za zaključivanje o najbližem identitetu (IBS) pacijentovog genotipskog statusa (IBS), isključujući nedodijeljene ćelije i ćelije identificirane kao dupleksi i odgovarajuće donore između uzoraka ascitesa i tumora (54). Na osnovu ovog zadatka, zadržali smo tri slučaja s obilnom zastupljenošću ćelija u tumoru i ascitesu za daljnju analizu. Nakon izvođenja koraka masene filtracije u scater (55) i scran (56) BioConductor pakiranju, ovo je dalo 6975 ćelija (2792 i 4183 ćelije iz tumora i ascitesa, respektivno) za analizu. Koristimo igraph-ovo (57) Louvain klasteriranje dijeljene mreže najbližih susjeda (SNN) na osnovu Jaccard udaljenosti do klaster ćelija putem ekspresije. Klasteri su ručno označeni kao pretpostavljeni tipovi ćelija na osnovu ekspresije marker gena i vizualizirani pomoću t-SNE. Citotoksične T ćelije su definirane ekspresijom CD8A i GZMA, isključujući podklastere sa niskom ekspresijom ribosomskih proteina. Pristupili smo objavljenim podacima Izara i saradnika (16), uključujući njihovo ugrađivanje t-SNE, koji mogu kontrolisati preklapanje ekspresije između markera imunih ćelija i ekspresije NNMT.
PBMC su odvojene od produkata separacije leukocita (STEMCELL Technologies) centrifugiranjem u gradijentu gustine Ficoll-a. CD3+ ćelije su izolovane iz PBMC korištenjem CD3 kuglica (Miltenyi). U prisustvu ili odsustvu MNA, CD3+ ćelije su aktivirane sa CD3 vezanim za ploču (5μg/ml), rastvorljivim CD28 (3μg/ml) i IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Posljednjeg dana ekspanzije, vijabilnost (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) i proliferacija (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) su procijenjene protočnom citometrijom. Procijenite efektorsku funkciju stimuliranjem ćelija sa PMA (20 ng/ml) i ionomicinom (1 μg/ml) pomoću GolgiStop-a tokom 4 sata, te pratite CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) i TNFα-fluorescein izotiocijanat (FITC) (MAb11, BD). Stimulirajte qPCR i ChIP ćelije sa PMA (20 ng/ml) i ionomicinom (1 μg/ml) tokom 4 sata. ELISA supernatant je sakupljen prije i nakon stimulacije sa PMA (20 ng/ml) i ionomicinom (1 μg/ml) tokom 4 sata.
Slijedite protokol proizvođača za izolaciju RNK pomoću RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Koristite QIAshredder (QIAGEN) za homogenizaciju uzorka. Koristite kit visokog kapaciteta RNK za cDNA (Thermo Fisher Scientific) za sintezu komplementarne DNK (cDNK). Koristite TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) za kvantifikaciju ekspresije gena (prema protokolu proizvođača) sa sljedećim probama: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehid-3-fosfat bez vodika (GAPDH)] i Hs01010726_m1 (SLC22A2). Uzorci su analizirani na StepOnePlus real-time PCR sistemu (Applied Biosystems) u MicroAmp brzoj optičkoj reakcijskoj ploči sa 96 jažica (Applied Biosystems) sa MicroAmp optičkim filmom. Svaka Ct vrijednost koja prelazi 35 smatra se iznad praga detekcije i označava se kao nedetektabilna.
Izvršite ChIP kao što je prethodno opisano (58). Ukratko, ćelije su tretirane formaldehidom (konačna koncentracija 1,42%) i inkubirane na sobnoj temperaturi 10 minuta. Koristite dopunjeni pufer za bubrenje (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl i 0,1% NP-40) na ledu 10 minuta, a zatim resuspendirajte u imunoprecipitacijskom puferu kao što je opisano (58). Uzorak je zatim soniciran sa sljedećim ciklusima: 10 ciklusa (20 impulsa od 1 sekunde) i statičkim vremenom od 40 sekundi. Inkubirajte ChIP-kvalitet imunoglobulina G (Cell Signaling Technology; 1 μl), histona H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) i SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) antitijela s uzorkom na 4°CC i mućkajte preko noći. Inkubirajte kuglice proteina A (Thermo Fisher Scientific) s uzorkom na 4°C uz lagano mućkanje tokom 1 sata, zatim koristite chelex kuglice (Bio-Rad) za obogaćivanje DNK i koristite proteinazu K (Thermo Fisher) za digestiju proteina. TNFα promotor je detektovan PCR-om: naprijed, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; nasuprot tome, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produkt od 207 bp). Slike je napravio Image Lab (Bio-Rad) i kvantificirao pomoću ImageJ softvera.
Supernatant ćelijske kulture je sakupljen kao što je gore opisano. Određivanje je provedeno prema procedurama proizvođača za ELISA kit za humani TNFα (Invitrogen), ELISA kit za humani IL-2 (Invitrogen) i ELISA kit za humani IFN-γ (Abcam). Prema protokolu proizvođača, supernatant je razrijeđen 1:100 za detekciju TNFα i IL-2, te 1:3 za detekciju IFN-γ. Za mjerenje apsorbancije na 450 nm korišten je EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer).
PBMC su odvojene od produkata separacije leukocita (STEMCELL Technologies) centrifugiranjem u gradijentu gustine Ficoll-a. CD3+ ćelije su izolovane iz PBMC korištenjem CD3 kuglica (Miltenyi). U prisustvu ili odsustvu MNA, CD3+ ćelije su aktivirane sa CD3 vezanim za ploču (5μg/ml), rastvorljivim CD28 (3μg/ml) i IL-2 (300 U/ml; Proleukin) tokom 3 dana. Nakon 3 dana, ćelije su sakupljene i isprane sa 0,9% fiziološkim rastvorom, a talog je brzo zamrznut. Brojanje ćelija je izvršeno protočnom citometrijom (Cytek Aurora; konfiguracija 3L-16V-14B-8R) korištenjem eBeads od 123 count.
Ekstrakt metabolita se vrši kao što je gore opisano. Osušeni ekstrakt je rekonstituisan pri koncentraciji od 4000 ćelijskih ekvivalenata/μl. Uzorak se analizira reverzno-faznom hromatografijom (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i CORTECS T3 kolonom (2,1×150 mm, veličina čestica 1,6 μm, veličina pora 120 Å; #186008500, Waters). Polarni maseni spektrometar (6470, Agilent), u kojem elektrosprejna ionizacija radi u pozitivnom modu. Mobilna faza A je 0,1% mravlja kiselina (u H2O), mobilna faza B je 90% acetonitril, 0,1% mravlja kiselina. LC gradijent je 0 do 2 minute za 100% A, 2 do 7,1 minuta za 99% B i 7,1 do 8 minuta za 99% B. Zatim ponovo uravnotežite kolonu mobilnom fazom A pri brzini protoka od 0,6 ml/min tokom 3 minute. Brzina protoka je 0,4 ml/min, a komora kolone se zagrijava na 50°C. Koristite MNA-ov standard čistog hemijskog sastojka (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) za utvrđivanje vremena zadržavanja (RT) i transformacije (RT = 0,882 minute, transformacija 1 = 137→94,1, transformacija 2 = 137→92, konverzija 3 = 137→78). Kada se sva tri prelaza dogode u tačnom vremenu zadržavanja, prelaz 1 se koristi za kvantifikaciju kako bi se osigurala specifičnost. Standardna krivulja MNA (Toronto Research Chemical Company) generirana je pomoću šest serijskih razrjeđenja osnovnog rastvora (1 mg/ml) kako bi se dobili standardi od 0,1, 1,0, 10 i 100 ng/ml i 1,0 i 10 μg/ml respektivno tekućine. Granica detekcije je 1 ng/ml, a linearni odgovor je između 10 ng/ml i 10 μg/ml. Svaka injekcija od dva mikrolitra uzorka i standarda koristi se za LC/MS analizu, a miješani uzorak kontrole kvalitete se provodi svakih osam injekcija kako bi se osigurala stabilnost analitičke platforme. MNA odgovori svih uzoraka ćelija tretiranih MNA bili su unutar linearnog raspona testa. Analiza podataka urađena je korištenjem softvera za kvantitativnu analizu MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstrukt αFR-CAR druge generacije preuzet je od Songa i saradnika (59). Ukratko, konstrukt sadrži sljedeći sadržaj: vodeću sekvencu CD8a, ljudski αFR-specifični varijabilni fragment jednog lanca, zglobnu i transmembransku regiju CD8a, intracelularni domen CD27 i intracelularni domen CD3z. Kompletna CAR sekvenca je sintetizirana pomoću GenScript-a, a zatim klonirana u lentivirusni vektor ekspresije druge generacije uzvodno od GFP kasete ekspresije korištene za procjenu efikasnosti transdukcije.
Lentivirus se proizvodi transfekcijom HEK293T ćelija [American Type Culture Collection (ATCC); uzgajane u Dulbeccoovom modificiranom Eagle mediju koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 1% PenStrepa, a korišten je CAR-GFP vektor i plazmidi za pakovanje (psPAX2 i pMD2.G, Addgene) koriste lipofekcijski amin (Sigma-Aldrich). Supernatant koji sadrži virus sakupljen je 48 i 72 sata nakon transfekcije, filtriran i koncentriran ultracentrifugiranjem. Koncentrirani virusni supernatant čuvati na -80°C do transdukcije.
PBMC se odvajaju od produkata separacije leukocita zdravih donora (STEMCELL Technologies) centrifugiranjem s Ficoll gradijentom gustoće. Koristite CD8 mikrokuglice pozitivne selekcije (Miltenyi) za izolaciju CD8+ ćelija iz PBMC. Stimulirajte T ćelije s TransAct (Miltenyi) i u TexMACS mediju [Miltenyi; dopunjenom s 3% toplinski inaktiviranog ljudskog seruma, 1% PenStrep i IL-2 (300 U/ml)]. Dvadeset četiri sata nakon stimulacije, T ćelije su transducirane lentivirusom (10 μl koncentriranog virusnog supernatanta na 106 ćelija). 1 do 3 dana nakon transdukcije na Cytek Aurora (na FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), procijenite GFP ekspresiju ćelija kako biste pokazali efikasnost transdukcije od najmanje 30%.
CAR-T ćelije su kultivirane 24 sata u Immunocultu (STEMCELL Technologies; dopunjeno sa 1% PenStrep) pod sljedećim uslovima: netretirane, tretirane sa 250 μM adenozina ili 10 mM MNA. Nakon prethodne obrade, CAR-T ćelije su isprane sa PBS-om i kombinovane sa 20.000 SK-OV-3 ćelija [ATCC; u McCoy 5A medijumu (Sigma-Aldrich) dopunjenom sa 10% FBS i 1% PenStrep-a pri 10: Odnos efektora i cilja od 1 je amplifikovan u tri primjerka u dopunjenom Immunocult medijumu. SK-OV-3 ćelije i SK-OV-3 ćelije lizirane sa digitalis saponinom (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) korištene su kao negativne i pozitivne kontrole. Nakon 24 sata kokultivacije, supernatant je sakupljen i laktat dehidrogenaza (LDH) je izmjerena prema uputama proizvođača (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH supernatant je razrijeđen 1:50 u LDH puferu. Procenat ubijanja je mjeren korištenjem sljedeće formule: procenat ubijanja = procenat korekcije / maksimalna stopa ubijanja x 100%, gdje je procenat korekcije = samo ko-kultura-T ćelija, a maksimalna stopa ubijanja = pozitivna kontrola-negativna kontrola.
Kao što je opisano u tekstu ili materijalima i metodama, koristite GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ili R v3.6.0 za statističku analizu. Ako se od istog pacijenta prikupi više uzoraka (kao što su ascites i tumor), koristimo t-test za uparene uzorke ili uključujemo pacijenta kao slučajni efekat u linearni ili generalizirani model, prema potrebi. Za metabolomsku analizu, test važnosti se provodi u tri primjerka.
Za dodatne materijale za ovaj članak, pogledajte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod uslovima Creative Commons licence Attribution-Non-Commercial, koja dozvoljava korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, sve dok konačna upotreba nije u komercijalne svrhe i pretpostavka je da je originalno djelo ispravno. Referenca.
Napomena: Molimo vas da navedete svoju email adresu samo kako bi osoba koju preporučite stranici znala da želite da vidi email i da se ne radi o neželjenoj pošti. Nećemo prikupljati email adrese.
Ovo pitanje se koristi za provjeru da li ste posjetilac i sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Raph J.R. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA doprinosi imunosupresiji T ćelija i predstavlja potencijalnu metu imunoterapije za liječenje raka kod ljudi.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Raph J.R. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA doprinosi imunosupresiji T ćelija i predstavlja potencijalnu metu imunoterapije za liječenje raka kod ljudi.
©2021 Američko udruženje za unapređenje nauke. sva prava pridržana. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.