Propionska kiselina (PPA), antifungalno sredstvo i uobičajeni dodatak prehrani, dokazano uzrokuje abnormalni neurološki razvoj kod miševa praćen gastrointestinalnom disfunkcijom, što može biti uzrokovano crijevnom disbiozom. Veza između izloženosti PPA u prehrani i disbioze crijevne mikrobiote je sugerirana, ali nije direktno istražena. Ovdje smo istražili promjene u sastavu crijevne mikrobiote povezane s PPA koje mogu dovesti do disbioze. Crijevni mikrobiomi miševa hranjenih netretiranom prehranom (n=9) i prehranom obogaćenom PPA (n=13) sekvencirani su korištenjem metagenomskog sekvenciranja dugog dometa kako bi se procijenile razlike u mikrobnom sastavu i bakterijskim metaboličkim putevima. PPA u prehrani bila je povezana s povećanjem brojnosti značajnih taksona, uključujući nekoliko vrsta Bacteroides, Prevotella i Ruminococcus, čiji su članovi prethodno bili uključeni u proizvodnju PPA. Mikrobiomi miševa izloženih PPA također su imali više puteva povezanih s metabolizmom lipida i biosintezom steroidnih hormona. Naši rezultati pokazuju da PPA može promijeniti crijevnu mikrobiotu i s njom povezane metaboličke puteve. Ove uočene promjene ističu da konzervansi klasifikovani kao sigurni za konzumaciju mogu uticati na sastav crijevne mikrobiote i, posljedično, na ljudsko zdravlje. Među njima, P, G ili S se biraju ovisno o nivou klasifikacije koji se analizira. Kako bi se minimizirao utjecaj lažno pozitivnih klasifikacija, usvojen je minimalni prag relativne abundancije od 1e-4 (1/10.000 očitanja). Prije statističke analize, relativne abundancije koje je prijavio Bracken (fraction_total_reads) transformirane su korištenjem transformacije centriranog log-ratio (CLR) (Aitchison, 1982). CLR metoda je odabrana za transformaciju podataka jer je nepromjenjiva u odnosu na skalu i dovoljna je za nerijetke skupove podataka (Gloor et al., 2017). CLR transformacija koristi prirodni logaritam. Podaci o brojanju koje je prijavio Bracken normalizirani su korištenjem relativnog logaritamskog izraza (RLE) (Anders i Huber, 2010). Slike su generirane korištenjem kombinacije matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 i sekvencijalnih logaritama (Gloor et al., 2017). 0.12.2 i stantanotacije v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Odnos Bacillus/Bacteroidetes izračunat je za svaki uzorak korištenjem normaliziranog broja bakterija. Vrijednosti prikazane u tabelama zaokružene su na 4 decimalna mjesta. Simpsonov indeks raznolikosti izračunat je korištenjem skripte alpha_diversity.py koja se nalazi u paketu KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Bracken izvještaj je dat u skripti, a Simpsonov indeks "Si" je dat za parametar -an. Značajne razlike u brojnosti definirane su kao srednje CLR razlike ≥ 1 ili ≤ -1. Srednja CLR razlika od ±1 ukazuje na 2,7-struko povećanje brojnosti tipa uzorka. Znak (+/-) označava da li je takson brojniji u PPA uzorku i kontrolnom uzorku. Značajnost je određena Mann-Whitneyjevim U testom (Virtanen et al., 2020). Korišten je Statsmodels v. 0.14 (Benjamini i Hochberg, 1995; Seabold i Perktold, 2010), a Benjamini-Hochbergova procedura je primijenjena za korekciju višestrukog testiranja. Prilagođena p-vrijednost ≤ 0,05 korištena je kao prag za određivanje statističke značajnosti.
Ljudski mikrobiom se često naziva "posljednjim organom tijela" i igra vitalnu ulogu u ljudskom zdravlju (Baquero i Nombela, 2012). Posebno je crijevni mikrobiom prepoznat po svom utjecaju na cijeli sistem i ulozi u mnogim esencijalnim funkcijama. Komenzalne bakterije su brojne u crijevima, zauzimajući više ekoloških niša, koristeći hranjive tvari i takmičeći se s potencijalnim patogenima (Jandhyala et al., 2015). Različite bakterijske komponente crijevnog mikrobiota sposobne su proizvoditi esencijalne hranjive tvari poput vitamina i promovirati probavu (Rowland et al., 2018). Također je dokazano da bakterijski metaboliti utječu na razvoj tkiva i poboljšavaju metaboličke i imunološke puteve (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Sastav ljudskog crijevnog mikrobioma izuzetno je raznolik i ovisi o genetskim i okolišnim faktorima kao što su prehrana, spol, lijekovi i zdravstveno stanje (Kumbhare et al., 2019).
Majčina prehrana je ključna komponenta fetalnog i neonatalnog razvoja i pretpostavljeni izvor spojeva koji mogu utjecati na razvoj (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Jedan takav spoj od interesa je propionska kiselina (PPA), nusproizvod kratkolančane masne kiseline dobiven bakterijskom fermentacijom i aditiv za hranu (den Besten et al., 2013). PPA ima antibakterijska i antifungalna svojstva i stoga se koristi kao konzervans za hranu i u industrijskim primjenama za inhibiranje rasta plijesni i bakterija (Wemmenhove et al., 2016). PPA ima različite učinke u različitim tkivima. U jetri, PPA ima protuupalne učinke utječući na ekspresiju citokina u makrofagima (Kawasoe et al., 2022). Ovaj regulatorni učinak uočen je i u drugim imunološkim ćelijama, što dovodi do smanjenja upale (Haase et al., 2021). Međutim, suprotan učinak uočen je u mozgu. Prethodne studije su pokazale da izloženost PPA izaziva ponašanje slično autizmu kod miševa (El-Ansary et al., 2012). Druge studije su pokazale da PPA može izazvati gliozu i aktivirati proinflamatorne puteve u mozgu (Abdelli et al., 2019). Budući da je PPA slaba kiselina, ona može difundirati kroz crijevni epitel u krvotok i tako preći restriktivne barijere, uključujući krvno-moždanu barijeru, kao i placentu (Stinson et al., 2019), što naglašava važnost PPA kao regulatornog metabolita koji proizvode bakterije. Iako se potencijalna uloga PPA kao faktora rizika za autizam trenutno istražuje, njeni učinci na osobe s autizmom mogu se proširiti i dalje od izazivanja neuronske diferencijacije.
Gastrointestinalni simptomi poput dijareje i zatvora česti su kod pacijenata s neurološkim razvojnim poremećajima (Cao et al., 2021). Prethodne studije su pokazale da se mikrobiom pacijenata s poremećajima iz autističnog spektra (PAS) razlikuje od mikrobioma zdravih osoba, što ukazuje na prisustvo disbioze crijevne mikrobiote (Finegold et al., 2010). Slično tome, karakteristike mikrobioma pacijenata s upalnim bolestima crijeva, pretilošću, Alzheimerovom bolešću itd. također se razlikuju od karakteristika zdravih osoba (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Međutim, do danas nije utvrđena uzročna veza između crijevnog mikrobioma i neuroloških bolesti ili simptoma (Yap et al., 2021), iako se smatra da nekoliko bakterijskih vrsta igra ulogu u nekim od ovih bolesnih stanja. Na primjer, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio i drugi rodovi su obilniji u mikrobioti pacijenata s autizmom (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Posebno je poznato da vrste članova nekih od ovih rodova posjeduju gene povezane s proizvodnjom PPA (Reichardt et al., 2014; Yun i Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur i Dürre, 2023). S obzirom na antimikrobna svojstva PPA, povećanje njene količine može biti korisno za rast bakterija koje proizvode PPA (Jacobson et al., 2018). Dakle, okruženje bogato PFA može dovesti do promjena u crijevnoj mikrobioti, uključujući gastrointestinalne patogene, što mogu biti potencijalni faktori koji dovode do gastrointestinalnih simptoma.
Centralno pitanje u istraživanju mikrobioma je da li su razlike u sastavu mikroba uzrok ili simptom osnovnih bolesti. Prvi korak ka razjašnjavanju složenog odnosa između prehrane, crijevnog mikrobioma i neuroloških bolesti je procjena utjecaja prehrane na sastav mikroba. U tu svrhu, koristili smo metagenomsko sekvenciranje dugog čitanja kako bismo uporedili crijevne mikrobiome potomstva miševa hranjenih prehranom bogatom ili siromašnom PPA. Potomci su hranjeni istom prehranom kao i njihove majke. Pretpostavili smo da će prehrana bogata PPA rezultirati promjenama u sastavu crijevnih mikroba i funkcionalnim putevima mikroba, posebno onima koji su povezani s metabolizmom PPA i/ili proizvodnjom PPA.
U ovoj studiji korišteni su transgenični miševi FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) koji prekomjerno eksprimiraju zeleni fluorescentni protein (GFP) pod kontrolom glia-specifičnog GFAP promotora, slijedeći smjernice Odbora za institucionalnu njegu i korištenje životinja Univerziteta Centralne Floride (UCF-IACUC) (broj dozvole za korištenje životinja: PROTO202000002). Nakon odbijanja od sisanja, miševi su smješteni pojedinačno u kaveze sa 1-5 miševa svakog spola po kavezu. Miševi su hranjeni ad libitum ili pročišćenom kontrolnom dijetom (modificirana otvorena standardna dijeta, 16 kcal% masti) ili dijetom s dodatkom natrijum propionata (modificirana otvorena standardna dijeta, 16 kcal% masti, koja sadrži 5.000 ppm natrijum propionata). Količina korištenog natrijum propionata bila je ekvivalentna 5.000 mg PFA/kg ukupne težine hrane. Ovo je najveća koncentracija PPA odobrena za upotrebu kao konzervans za hranu. Kako bi se pripremili za ovu studiju, roditeljski miševi su hranjeni objema vrstama hrane 4 sedmice prije parenja i nastavljeno je tokom cijele trudnoće majke. Potomci miševa [22 miša, 9 kontrolnih (6 mužjaka, 3 ženke) i 13 PPA (4 mužjaka, 9 ženki)] su odbijeni od dojke, a zatim su nastavili s istom ishranom kao i majke tokom 5 mjeseci. Potomci miševa su žrtvovani u dobi od 5 mjeseci, a njihov crijevni fekalni sadržaj je sakupljen i u početku pohranjen u mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 ml na -20°C, a zatim prebačen u zamrzivač na -80°C dok se DNK domaćina nije iscrpila i nukleinske kiseline mikroba nisu ekstrahirane.
DNK domaćina je uklonjena prema modificiranom protokolu (Charalampous et al., 2019). Ukratko, sadržaj fekalija je prebačen u 500 µl InhibitEX-a (Qiagen, Cat#/ID: 19593) i pohranjen zamrznut. Obraditi maksimalno 1-2 fekalne pelete po ekstrakciji. Sadržaj fekalija je zatim mehanički homogeniziran korištenjem plastičnog tučka unutar epruvete da bi se formirala suspenzija. Centrifugirati uzorke na 10.000 RCF tokom 5 minuta ili dok se uzorci ne peletira, zatim aspirirati supernatant i resuspendirati pelet u 250 µl 1× PBS. Dodati 250 µl 4,4% rastvora saponina (TCI, broj proizvoda S0019) u uzorak kao deterdžent za labavljenje eukariotskih ćelijskih membrana. Uzorci su lagano miješani dok ne postanu glatki i inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Zatim, da bi se razbile eukariotske ćelije, u uzorak je dodano 350 μl vode bez nukleaza, inkubirano 30 sekundi, a zatim je dodano 12 μl 5 M NaCl. Uzorci su zatim centrifugirani na 6000 RCF tokom 5 minuta. Supernatant se aspirira i talog se resuspendira u 100 μl 1X PBS. Da bi se uklonila DNK domaćina, doda se 100 μl HL-SAN pufera (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml vode bez nukleaza) i 10 μl HL-SAN enzima (ArticZymes P/N 70910-202). Uzorci su temeljito izmiješani pipetiranjem i inkubirani na 37 °C tokom 30 minuta pri 800 rpm na Eppendorf™ ThermoMixer C. Nakon inkubacije, centrifugirani su na 6000 RCF tokom 3 minute i isprani dva puta sa 800 µl i 1000 µl 1X PBS. Na kraju, talog je resuspendiran u 100 µl 1X PBS.
Ukupna bakterijska DNK je izolovana korištenjem New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit-a (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). Standardna operativna procedura koja se isporučuje s kompletom je neznatno modificirana. Inkubirajte i održavajte vodu bez nukleaza na 60°C prije operacije za konačnu eluciju. Dodajte 10 µl Proteinaze K i 3 µl RNase A u svaki uzorak. Zatim dodajte 100 µl pufera za lizu ćelija i lagano promiješajte. Uzorci su zatim inkubirani u Eppendorf™ ThermoMixer C na 56°C i 1400 rpm tokom najmanje 1 sata, a do 3 sata. Inkubirani uzorci su centrifugirani na 12.000 RCF tokom 3 minute, a supernatant iz svakog uzorka je prebačen u zasebnu mikrocentrifugalnu epruvetu od 1,5 mL koja sadrži 400 µL rastvora za vezivanje. Epruvete su zatim pulsirajuće miješane u vrtlogu tokom 5-10 sekundi u intervalima od 1 sekunde. Prebacite cjelokupni tečni sadržaj svakog uzorka (približno 600–700 µL) u filter uložak smješten u protočnu epruvetu za sakupljanje. Epruvete su centrifugirane na 1.000 RCF tokom 3 minute kako bi se omogućilo početno vezivanje DNK, a zatim centrifugirane na 12.000 RCF tokom 1 minute kako bi se uklonila preostala tečnost. Kolona uzorka je prebačena u novu epruvetu za sakupljanje, a zatim isprana dva puta. Za prvo pranje, dodajte 500 µL pufera za pranje u svaku epruvetu. Okrenite epruvetu 3–5 puta, a zatim centrifugirajte na 12.000 RCF tokom 1 minute. Bacite tečnost iz epruvete za sakupljanje i vratite filter uložak u istu epruvetu za sakupljanje. Za drugo pranje, dodajte 500 µL pufera za pranje u filter bez okretanja. Uzorci su centrifugirani na 12.000 RCF tokom 1 minute. Prebacite filter u LoBind® epruvetu od 1,5 mL i dodajte 100 µL prethodno zagrijane vode bez nukleaza. Filteri su inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 1 minute, a zatim centrifugirani na 12.000 RCF tokom 1 minute. Eluirana DNK je čuvana na -80°C.
Koncentracija DNK je kvantificirana korištenjem Qubit™ 4.0 fluorometra. DNK je pripremljena korištenjem Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit-a (kat. br. Q33231) prema uputama proizvođača. Raspodjela dužine DNK fragmenata mjerena je korištenjem Aglient™ 4150 ili 4200 TapeStation uređaja. DNK je pripremljena korištenjem Agilent™ Genomic DNA Reagents-a (kat. br. 5067-5366) i Genomic DNA ScreenTape-a (kat. br. 5067-5365). Priprema biblioteke je izvršena korištenjem Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit-a (SQK-RPB004) prema uputama proizvođača. DNK je sekvencirana korištenjem ONT GridION™ Mk1 sekvencera sa Min106D protočnom ćelijom (R 9.4.1). Postavke sekvenciranja su bile: visoka preciznost određivanja baza, minimalna q vrijednost od 9, podešavanje barkoda i skraćivanje barkoda. Uzorci su sekvencirani 72 sata, nakon čega su podaci o baznom pozivu poslani na daljnju obradu i analizu.
Bioinformatička obrada je izvršena korištenjem prethodno opisanih metoda (Greenman et al., 2024). FASTQ datoteke dobijene sekvenciranjem su podijeljene u direktorije za svaki uzorak. Prije bioinformatičke analize, podaci su obrađeni korištenjem sljedećeg cjevovoda: prvo, FASTQ datoteke uzoraka su spojene u jednu FASTQ datoteku. Zatim, očitavanja kraća od 1000 bp su filtrirana korištenjem Filtlonga v. 0.2.1, s jedinim promijenjenim parametrom –min_length 1000 (Wick, 2024). Prije daljnjeg filtriranja, kvalitet očitavanja je kontroliran korištenjem NanoPlota v. 1.41.3 sa sljedećim parametrima: –fastq –plots dot –N50 -o
Za taksonomsku klasifikaciju, očitanja i sastavljeni kontizi su klasifikovani pomoću Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Generišite izvještaje i izlazne datoteke za očitanja i sklopove, respektivno. Koristite opciju –use-names za analizu očitanja i sklopova. Opcije –gzip-compressed i –paired su navedene za segmente očitavanja. Relativna brojnost taksona u metagenomima procijenjena je pomoću Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Prvo smo kreirali kmer bazu podataka koja sadrži 1000 baza koristeći bracken-build sa sljedećim parametrima: -d
Anotacija gena i procjena relativne abundancije izvršeni su korištenjem modificirane verzije protokola koji su opisali Maranga i saradnici (Maranga i saradnici, 2023). Prvo su kontigi kraći od 500 bp uklonjeni iz svih sklopova korištenjem SeqKit v. 2.5.1 (Shen i saradnici, 2016). Odabrani sklopovi su zatim kombinovani u pan-metagenom. Otvoreni okviri za čitanje (ORF) identificirani su korištenjem Prodigal v. 1.0.1 (paralelna verzija Prodigal v. 2.6.3) sa sljedećim parametrima: -d
Geni su prvo grupirani prema ortološkim (KO) identifikatorima iz Kjoto enciklopedije gena i genoma (KEGG) koje je dodijelio eggNOG radi poređenja zastupljenosti genskih puteva. Geni bez knockouta ili geni sa višestrukim knockoutima uklonjeni su prije analize. Zatim je izračunata prosječna zastupljenost svakog KO po uzorku i izvršena je statistička analiza. Geni metabolizma PPA definirani su kao bilo koji gen kojem je dodijeljen red ko00640 u koloni KEGG_Pathway, što ukazuje na ulogu u metabolizmu propionata prema KEGG-u. Geni identificirani kao povezani s proizvodnjom PPA navedeni su u Dodatnoj tabeli 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Permutacijski testovi provedeni su kako bi se identificirali geni metabolizma i proizvodnje PPA koji su bili značajno zastupljeniji u svakoj vrsti uzorka. Za svaki analizirani gen izvršeno je hiljadu permutacija. P-vrijednost od 0,05 korištena je kao granična vrijednost za određivanje statističke značajnosti. Funkcionalne anotacije dodijeljene su pojedinačnim genima unutar klastera na osnovu anotacija reprezentativnih gena unutar klastera. Taksoni povezani s metabolizmom PPA i/ili proizvodnjom PPA mogli su se identificirati usklađivanjem kontig ID-ova u izlaznim datotekama Kraken2 s istim kontig ID-ovima zadržanim tokom funkcionalne anotacije korištenjem eggNOG-a. Testiranje značajnosti provedeno je korištenjem Mann-Whitney U testa opisanog ranije. Korekcija za višestruko testiranje izvršena je korištenjem Benjamini-Hochberg postupka. P-vrijednost ≤ 0,05 korištena je kao granična vrijednost za određivanje statističke značajnosti.
Raznolikost crijevnog mikrobioma miševa procijenjena je korištenjem Simpsonovog indeksa raznolikosti. Nisu uočene značajne razlike između kontrolnih i PPA uzoraka u smislu raznolikosti roda i vrste (p-vrijednost za rod: 0,18, p-vrijednost za vrstu: 0,16) (Slika 1). Mikrobni sastav je zatim upoređen korištenjem analize glavnih komponenti (PCA). Slika 2 prikazuje grupiranje uzoraka po njihovim koljenima, što ukazuje na to da su postojale razlike u sastavu vrsta mikrobioma između PPA i kontrolnih uzoraka. Ovo grupiranje je bilo manje izraženo na nivou roda, što sugerira da PPA utiče na određene bakterije (Dopunska slika 1).
Slika 1. Alfa raznolikost rodova i sastav vrsta crijevnog mikrobioma miša. Box dijagrami prikazuju Simpsonove indekse raznolikosti rodova (A) i vrsta (B) u PPA i kontrolnim uzorcima. Značajnost je određena Mann-Whitneyjevim U testom, a višestruka korekcija je izvršena Benjamini-Hochbergovim postupkom. ns, p-vrijednost nije bila značajna (p>0,05).
Slika 2. Rezultati analize glavnih komponenti sastava crijevnog mikrobioma miša na nivou vrste. Grafik analize glavnih komponenti prikazuje distribuciju uzoraka po njihove prve dvije glavne komponente. Boje označavaju vrstu uzorka: miševi izloženi PPA su ljubičasti, a kontrolni miševi žuti. Glavne komponente 1 i 2 su prikazane na x-osi i y-osi, respektivno, i izražene su kao njihov objašnjeni omjer varijanse.
Korištenjem podataka transformiranih RLE brojanja, uočeno je značajno smanjenje medijana odnosa Bacteroidetes/Bacilli kod kontrolnih i PPA miševa (kontrola: 9,66, PPA: 3,02; p-vrijednost = 0,0011). Ova razlika je bila posljedica veće brojnosti Bacteroidetes kod PPA miševa u poređenju s kontrolnom grupom, iako razlika nije bila značajna (prosječni CLR kontrole: 5,51, prosječni CLR PPA: 6,62; p-vrijednost = 0,054), dok je brojnost Bacteroidetes bila slična (prosječni CLR kontrole: 7,76, prosječni CLR PPA: 7,60; p-vrijednost = 0,18).
Analiza brojnosti taksonomskih članova crijevnog mikrobioma otkrila je da se 1 koljeno i 77 vrsta značajno razlikuju između PPA i kontrolnih uzoraka (Dodatna tabela 2). Brojnost 59 vrsta u PPA uzorcima bila je značajno veća nego u kontrolnim uzorcima, dok je brojnost samo 16 vrsta u kontrolnim uzorcima bila veća nego u PPA uzorcima (Slika 3).
Slika 3. Različita zastupljenost taksona u crijevnom mikrobiomu PPA i kontrolnih miševa. Vulkanski dijagrami prikazuju razlike u zastupljenosti rodova (A) ili vrsta (B) između PPA i kontrolnih uzoraka. Sive tačke ukazuju na to da nema značajne razlike u zastupljenosti taksona. Obojene tačke ukazuju na značajne razlike u zastupljenosti (p-vrijednost ≤ 0,05). Prvih 20 taksona s najvećim razlikama u zastupljenosti između tipova uzoraka prikazano je crvenom i svijetloplavom bojom (kontrolni i PPA uzorci). Žute i ljubičaste tačke bile su najmanje 2,7 puta zastupljenije u kontrolnim ili PPA uzorcima nego u kontrolnim. Crne tačke predstavljaju taksone sa značajno različitom zastupljenošću, sa srednjim CLR razlikama između -1 i 1. P vrijednosti su izračunate korištenjem Mann-Whitney U testa i korigovane za višestruko testiranje korištenjem Benjamini-Hochberg postupka. Podebljane srednje CLR razlike ukazuju na značajne razlike u zastupljenosti.
Nakon analize sastava crijevne mikroflore, izvršili smo funkcionalnu anotaciju mikrobioma. Nakon filtriranja gena niske kvalitete, ukupno 378.355 jedinstvenih gena identificirano je u svim uzorcima. Transformirana abundancija ovih gena korištena je za analizu glavnih komponenti (PCA), a rezultati su pokazali visok stepen grupiranja tipova uzoraka na osnovu njihovih funkcionalnih profila (Slika 4).
Slika 4. Rezultati PCA korištenjem funkcionalnog profila crijevnog mikrobioma miša. PCA grafik prikazuje distribuciju uzoraka po njihovim prve dvije glavne komponente. Boje označavaju vrstu uzorka: miševi izloženi PPA su ljubičasti, a kontrolni miševi žuti. Glavne komponente 1 i 2 su prikazane na x-osi i y-osi, respektivno, i izražene su kao njihov objašnjeni omjer varijanse.
Zatim smo ispitali zastupljenost KEGG knockouta u različitim tipovima uzoraka. Ukupno je identificirano 3648 jedinstvenih knockouta, od kojih je 196 bilo značajno zastupljenije u kontrolnim uzorcima, a 106 u PPA uzorcima (Slika 5). Ukupno 145 gena otkriveno je u kontrolnim uzorcima i 61 gen u PPA uzorcima, sa značajno različitim zastupljenostima. Putevi povezani s metabolizmom lipida i aminošećera bili su značajno bogatiji u PPA uzorcima (Dodatna tabela 3). Putevi povezani s metabolizmom dušika i sistemima sumpornih releja bili su značajno bogatiji u kontrolnim uzorcima (Dodatna tabela 3). Obilje gena povezanih s metabolizmom aminošećera/nukleotida (ko:K21279) i metabolizmom inozitol fosfata (ko:K07291) bilo je značajno veće u PPA uzorcima (Slika 5). Kontrolni uzorci imali su značajno više gena povezanih s metabolizmom benzoata (ko:K22270), metabolizmom dušika (ko:K00368) i glikolizom/glukoneogenezom (ko:K00131) (Slika 5).
Sl. 5. Različita zastupljenost KO u crijevnom mikrobiomu PPA i kontrolnih miševa. Vulkanski dijagram prikazuje razlike u zastupljenosti funkcionalnih grupa (KO). Sive tačke označavaju KO čija se zastupljenost nije značajno razlikovala između tipova uzoraka (p-vrijednost > 0,05). Obojene tačke označavaju značajne razlike u zastupljenosti (p-vrijednost ≤ 0,05). 20 KO sa najvećim razlikama u zastupljenosti između tipova uzoraka prikazano je crvenom i svijetloplavom bojom, što odgovara kontrolnim i PPA uzorcima. Žute i ljubičaste tačke označavaju KO koji su bili najmanje 2,7 puta zastupljeniji u kontrolnim i PPA uzorcima. Crne tačke označavaju KO sa značajno različitom zastupljenošću, sa srednjim razlikama CLR između -1 i 1. P vrijednosti su izračunate korištenjem Mann-Whitney U testa i prilagođene za višestruka poređenja korištenjem Benjamini-Hochberg postupka. NaN označava da KO ne pripada putu u KEGG. Podebljane srednje vrijednosti razlike CLR označavaju značajne razlike u zastupljenosti. Za detaljne informacije o putevima kojima pripadaju navedeni KO, pogledajte Dodatnu tabelu 3.
Među označenim genima, 1601 gen je imao značajno različitu zastupljenost između tipova uzoraka (p ≤ 0,05), pri čemu je svaki gen bio najmanje 2,7 puta zastupljeniji. Od ovih gena, 4 gena su bila zastupljenija u kontrolnim uzorcima, a 1597 gena u uzorcima PPA. Budući da PPA ima antimikrobna svojstva, ispitali smo zastupljenost gena povezanih s metabolizmom i proizvodnjom PPA između tipova uzoraka. Među 1332 gena povezanih s metabolizmom PPA, 27 gena je bilo značajno zastupljenije u kontrolnim uzorcima, a 12 gena u uzorcima PPA. Među 223 gena povezanih s proizvodnjom PPA, 1 gen je bio značajno zastupljeniji u uzorcima PPA. Slika 6A dodatno pokazuje veću zastupljenost gena uključenih u metabolizam PPA, sa značajno većom zastupljenošću u kontrolnim uzorcima i velikim veličinama efekta, dok Slika 6B ističe pojedinačne gene sa značajno većom zastupljenošću uočenom u uzorcima PPA.
Sl. 6. Diferencijalna zastupljenost gena povezanih s PPA u crijevnom mikrobiomu miša. Vulkanski dijagrami prikazuju razlike u zastupljenosti gena povezanih s metabolizmom PPA (A) i proizvodnjom PPA (B). Sive tačke označavaju gene čija se zastupljenost nije značajno razlikovala između tipova uzoraka (p-vrijednost > 0,05). Obojene tačke označavaju značajne razlike u zastupljenosti (p-vrijednost ≤ 0,05). 20 gena s najvećim razlikama u zastupljenosti prikazano je crvenom i svijetloplavom bojom (kontrolni i PPA uzorci), respektivno. Zastupljenost žutih i ljubičastih tačaka bila je najmanje 2,7 puta veća u kontrolnim i PPA uzorcima nego u kontrolnim uzorcima. Crne tačke predstavljaju gene sa značajno različitom zastupljenošću, sa srednjim razlikama CLR između -1 i 1. P vrijednosti su izračunate korištenjem Mann-Whitney U testa i korigovane za višestruka poređenja korištenjem Benjamini-Hochberg postupka. Geni odgovaraju reprezentativnim genima u katalogu neredundantnih gena. Imena gena sastoje se od KEGG simbola koji označava KO gen. Podebljane srednje razlike CLR označavaju značajno različite zastupljenosti. Crtica (-) označava da u KEGG bazi podataka ne postoji simbol za taj gen.
Taksoni s genima povezanim s metabolizmom i/ili proizvodnjom PPA identificirani su uparivanjem taksonomskog identiteta kontiga s kontig ID-om gena. Na nivou roda, pronađeno je 130 rodova koji imaju gene povezane s metabolizmom PPA, a 61 rod koji ima gene povezane s proizvodnjom PPA (Dodatna tabela 4). Međutim, nijedan rod nije pokazao značajne razlike u brojnosti (p > 0,05).
Na nivou vrste, pronađeno je 144 bakterijske vrste koje imaju gene povezane s metabolizmom PPA, a 68 bakterijskih vrsta ima gene povezane s proizvodnjom PPA (Dodatna tabela 5). Među metabolizatorima PPA, osam bakterija pokazalo je značajno povećanje brojnosti između tipova uzoraka, a sve su pokazale značajne promjene u efektu (Dodatna tabela 6). Svi identifikovani metabolizatori PPA sa značajnim razlikama u brojnosti bili su brojniji u uzorcima PPA. Klasifikacija na nivou vrste otkrila je predstavnike rodova koji se nisu značajno razlikovali između tipova uzoraka, uključujući nekoliko vrsta Bacteroides i Ruminococcus, kao i Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus i Alcaligenes polymorpha. Među bakterijama koje proizvode PPA, četiri bakterije pokazale su značajne razlike u brojnosti između tipova uzoraka. Vrste sa značajnim razlikama u brojnosti uključivale su Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis i Ruminococcus bovis.
U ovoj studiji ispitali smo efekte izloženosti PPA na crijevnu mikrobiotu miševa. PPA može izazvati različite reakcije kod bakterija jer je proizvode određene vrste, koriste je kao izvor hrane druge vrste ili ima antimikrobne efekte. Stoga, njeno dodavanje u crijevnu sredinu putem dodataka prehrani može imati različite efekte ovisno o toleranciji, osjetljivosti i sposobnosti korištenja kao izvora hranjivih tvari. Osjetljive bakterijske vrste mogu se eliminirati i zamijeniti onima koje su otpornije na PPA ili koje je mogu koristiti kao izvor hrane, što dovodi do promjena u sastavu crijevne mikrobiote. Naši rezultati otkrili su značajne razlike u mikrobnom sastavu, ali ne i uticaj na ukupnu mikrobnu raznolikost. Najveći efekti uočeni su na nivou vrste, sa preko 70 taksona koji se značajno razlikuju u brojnosti između uzoraka PPA i kontrolnih uzoraka (Dodatna tabela 2). Daljnja evaluacija sastava uzoraka izloženih PPA otkrila je veću heterogenost mikrobnih vrsta u poređenju sa neizloženim uzorcima, što sugerira da PPA može poboljšati karakteristike rasta bakterija i ograničiti bakterijske populacije koje mogu preživjeti u okruženjima bogatim PPA. Dakle, PPA može selektivno izazvati promjene, a ne uzrokovati široko rasprostranjeno narušavanje raznolikosti crijevne mikrobiote.
Prethodno je pokazano da konzervansi za hranu poput PPA mijenjaju brojnost komponenti crijevnog mikrobioma bez utjecaja na ukupnu raznolikost (Nagpal et al., 2021). Ovdje smo uočili najupečatljivije razlike između vrsta Bacteroidetes unutar koljena Bacteroidetes (ranije poznatih kao Bacteroidetes), koje su bile značajno obogaćene kod miševa izloženih PPA. Povećana brojnost vrsta Bacteroides povezana je s povećanom razgradnjom sluzi, što može povećati rizik od infekcije i potaknuti upalu (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Jedna studija je otkrila da su neonatalni mužjaci miševa tretirani Bacteroides fragilis pokazivali socijalno ponašanje koje podsjeća na poremećaj iz autističnog spektra (ASD) (Carmel et al., 2023), a druge studije su pokazale da vrste Bacteroides mogu promijeniti imunološku aktivnost i dovesti do autoimune inflamatorne kardiomiopatije (Gil-Cruz et al., 2019). Vrste koje pripadaju rodovima Ruminococcus, Prevotella i Parabacteroides također su bile značajno povećane kod miševa izloženih PPA (Coretti et al., 2018). Određene vrste Ruminococcus povezane su s bolestima poput Crohnove bolesti putem proizvodnje proinflamatornih citokina (Henke et al., 2019), dok su vrste Prevotella poput Prevotella humani povezane s metaboličkim bolestima poput hipertenzije i osjetljivosti na inzulin (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Konačno, otkrili smo da je omjer Bacteroidetes (ranije poznatih kao Firmicutes) i Bacteroidetes bio značajno niži kod miševa izloženih PPA nego kod kontrolnih miševa zbog veće ukupne brojnosti vrsta Bacteroidetes. Prethodno se pokazalo da je ovaj omjer važan pokazatelj crijevne homeostaze, a poremećaji u ovom omjeru povezani su s različitim bolesnim stanjima (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), uključujući upalne bolesti crijeva (Stojanov et al., 2020). Zajedno, čini se da su vrste iz koljena Bacteroidetes najviše pogođene povišenim PPA u prehrani. To može biti zbog veće tolerancije na PPA ili sposobnosti korištenja PPA kao izvora energije, što se pokazalo tačnim za barem jednu vrstu, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Alternativno, izloženost majke PPA može poboljšati razvoj fetusa čineći crijeva mišjeg potomstva podložnijim kolonizaciji Bacteroidetes; međutim, naš dizajn studije nije omogućio takvu procjenu.
Metagenomska procjena sadržaja otkrila je značajne razlike u zastupljenosti gena povezanih s metabolizmom i proizvodnjom PPA, pri čemu su miševi izloženi PPA pokazali veću zastupljenost gena odgovornih za proizvodnju PPA, dok su miševi koji nisu bili izloženi PPA pokazali veću zastupljenost gena odgovornih za metabolizam PAA (Slika 6). Ovi rezultati sugeriraju da učinak PPA na mikrobni sastav možda nije isključivo posljedica njegove upotrebe, inače bi zastupljenost gena povezanih s metabolizmom PPA trebala pokazati veću zastupljenost u crijevnom mikrobiomu miševa izloženih PPA. Jedno objašnjenje je da PPA posreduje u zastupljenosti bakterija prvenstveno putem svojih antimikrobnih učinaka, a ne putem upotrebe od strane bakterija kao hranjive tvari. Prethodne studije su pokazale da PPA inhibira rast Salmonella Typhimurium na način koji ovisi o dozi (Jacobson et al., 2018). Izloženost višim koncentracijama PPA može selektirati bakterije koje su otporne na njegova antimikrobna svojstva i ne moraju nužno biti u stanju metabolizirati ga ili proizvesti. Na primjer, nekoliko vrsta Parabacteroides pokazalo je značajno veću zastupljenost u uzorcima PPA, ali nisu detektovani geni povezani s metabolizmom ili proizvodnjom PPA (Dodatne tabele 2, 4 i 5). Nadalje, proizvodnja PPA kao nusprodukta fermentacije široko je rasprostranjena među različitim bakterijama (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Veća bakterijska raznolikost može biti razlog veće zastupljenosti gena povezanih s metabolizmom PPA u kontrolnim uzorcima (Averina et al., 2020). Nadalje, predviđeno je da su samo 27 (2,14%) od 1332 gena geni povezani isključivo s metabolizmom PPA. Mnogi geni povezani s metabolizmom PPA također su uključeni u druge metaboličke puteve. Ovo dodatno pokazuje da je zastupljenost gena uključenih u metabolizam PPA bila veća u kontrolnim uzorcima; ovi geni mogu funkcionirati u putevima koji ne rezultiraju korištenjem ili stvaranjem PPA kao nusprodukta. U ovom slučaju, samo jedan gen povezan s stvaranjem PPA pokazao je značajne razlike u zastupljenosti između tipova uzoraka. Za razliku od gena povezanih s metabolizmom PPA, marker geni za proizvodnju PPA su odabrani jer su direktno uključeni u bakterijski put za proizvodnju PPA. Kod miševa izloženih PPA, utvrđeno je da sve vrste imaju značajno povećanu brojnost i kapacitet za proizvodnju PPA. Ovo podržava predviđanje da će PPA odabrati proizvođače PPA i stoga predviđaju da će se kapacitet proizvodnje PPA povećati. Međutim, brojnost gena ne mora nužno korelirati s ekspresijom gena; stoga, iako je brojnost gena povezanih s metabolizmom PPA veća u kontrolnim uzorcima, stopa ekspresije može biti drugačija (Shi et al., 2014). Da bi se potvrdila veza između prevalencije gena koji proizvode PPA i proizvodnje PPA, potrebna su istraživanja ekspresije gena uključenih u proizvodnju PPA.
Funkcionalna anotacija PPA i kontrolnih metagenoma otkrila je neke razlike. PCA analiza sadržaja gena otkrila je diskretne klastere između PPA i kontrolnih uzoraka (Slika 5). Grupiranje unutar uzorka otkrilo je da je sadržaj kontrolnih gena bio raznolikiji, dok su se PPA uzorci grupirali zajedno. Grupiranje po sadržaju gena bilo je usporedivo s grupiranjem po sastavu vrsta. Dakle, razlike u brojnosti puteva konzistentne su s promjenama u brojnosti specifičnih vrsta i sojeva unutar njih. U PPA uzorcima, dva puta sa značajno većom brojnošću bila su povezana s metabolizmom aminošećera/nukleotida šećera (ko:K21279) i višestrukim putevima metabolizma lipida (ko:K00647, ko:K03801; Dodatna tablica 3). Poznato je da su geni povezani s ko:K21279 povezani s rodom Bacteroides, jednim od rodova sa značajno većim brojem vrsta u PPA uzorcima. Ovaj enzim može izbjeći imunološki odgovor ekspresijom kapsularnih polisaharida (Wang et al., 2008). Ovo može objasniti porast broja Bacteroidetes uočen kod miševa izloženih PPA-u. Ovo nadopunjuje povećanu sintezu masnih kiselina uočenu u PPA mikrobiomu. Bakterije koriste FASIIko:K00647 (fabB) put za proizvodnju masnih kiselina, što može utjecati na metaboličke puteve domaćina (Yao i Rock, 2015; Johnson et al., 2020), a promjene u metabolizmu lipida mogu igrati ulogu u neurološkom razvoju (Yu et al., 2020). Drugi put koji pokazuje povećanu zastupljenost u PPA uzorcima bila je biosinteza steroidnih hormona (ko:K12343). Sve je više dokaza da postoji obrnuta veza između sposobnosti crijevne mikrobiote da utječe na nivoe hormona i da bude pod utjecajem hormona, tako da povišeni nivoi steroida mogu imati posljedice po zdravlje (Tetel et al., 2018).
Ova studija nije bez ograničenja i razmatranja. Važna razlika je da nismo proveli fiziološke procjene životinja. Stoga nije moguće direktno zaključiti da li su promjene u mikrobiomu povezane s bilo kojom bolešću. Drugo razmatranje je da su miševi u ovoj studiji hranjeni istom prehranom kao i njihove majke. Buduće studije mogu utvrditi da li prelazak s prehrane bogate PPA na prehranu bez PPA poboljšava njene učinke na mikrobiom. Jedno od ograničenja naše studije, kao i mnogih drugih, jeste ograničena veličina uzorka. Iako se mogu izvući valjani zaključci, veći uzorak bi pružio veću statističku snagu prilikom analize rezultata. Također smo oprezni u pogledu izvođenja zaključaka o povezanosti između promjena u crijevnom mikrobiomu i bilo koje bolesti (Yap et al., 2021). Zbunjujući faktori, uključujući dob, spol i prehranu, mogu značajno utjecati na sastav mikroorganizama. Ovi faktori mogu objasniti nedosljednosti uočene u literaturi u vezi s povezanošću crijevnog mikrobioma sa složenim bolestima (Johnson et al., 2019; Lagod i Naser, 2023). Na primjer, pokazano je da su članovi roda Bacteroidetes ili povećani ili smanjeni kod životinja i ljudi s ASD-om (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Slično tome, studije sastava crijeva kod pacijenata s upalnim bolestima crijeva otkrile su i povećanja i smanjenja kod istih taksona (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Kako bismo ograničili utjecaj rodne pristranosti, pokušali smo osigurati jednaku zastupljenost spolova tako da su razlike najvjerovatnije uzrokovane prehranom. Jedan od izazova funkcionalne anotacije je uklanjanje redundantnih genskih sekvenci. Naša metoda grupiranja gena zahtijeva 95% identiteta sekvenci i 85% sličnosti dužine, kao i 90% pokrivenosti poravnanja kako bi se eliminiralo lažno grupiranje. Međutim, u nekim slučajevima smo uočili COG-ove s istim anotacijama (npr. MUT) (Slika 6). Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se utvrdilo jesu li ovi ortolozi različiti, povezani sa specifičnim rodovima ili je ovo ograničenje pristupa grupiranja gena. Još jedno ograničenje funkcionalne anotacije je potencijalna pogrešna klasifikacija; bakterijski gen mmdA je poznati enzim uključen u sintezu propionata, ali KEGG ga ne povezuje s metaboličkim putem propionata. Nasuprot tome, ortolozi scpB i mmcD su povezani. Veliki broj gena bez označenih nokauta može rezultirati nemogućnošću identifikacije gena povezanih s PPA prilikom procjene broja gena. Buduće studije će imati koristi od analize metatranskriptoma, koja može pružiti dublje razumijevanje funkcionalnih karakteristika crijevne mikrobiote i povezati ekspresiju gena s potencijalnim nizvodnim efektima. Za studije koje uključuju specifične neurološke razvojne poremećaje ili upalne bolesti crijeva, potrebne su fiziološke i bihevioralne procjene životinja kako bi se promjene u sastavu mikrobioma povezale s ovim poremećajima. Dodatne studije transplantacije crijevnog mikrobioma u miševe bez klica također bi bile korisne za utvrđivanje je li mikrobiom pokretač ili karakteristika bolesti.
Ukratko, pokazali smo da PPA u ishrani djeluje kao faktor u promjeni sastava crijevne mikrobiote. PPA je konzervans odobren od strane FDA, koji se široko nalazi u raznim namirnicama i koji, nakon dugotrajnog izlaganja, može dovesti do poremećaja normalne crijevne flore. Otkrili smo promjene u brojnosti nekoliko bakterija, što ukazuje na to da PPA može utjecati na sastav crijevne mikrobiote. Promjene u mikrobioti mogu dovesti do promjena u nivoima određenih metaboličkih puteva, što može dovesti do fizioloških promjena koje su relevantne za zdravlje domaćina. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se utvrdilo mogu li učinci PPA u ishrani na mikrobni sastav dovesti do disbioze ili drugih bolesti. Ova studija postavlja temelje za buduća istraživanja o tome kako učinci PPA na sastav crijeva mogu utjecati na ljudsko zdravlje.
Skupovi podataka predstavljeni u ovoj studiji dostupni su u online repozitorijima. Naziv repozitorija i pristupni broj su: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Ovu studiju na životinjama odobrio je Odbor za institucionalnu njegu i korištenje životinja Univerziteta Centralne Floride (UCF-IACUC) (broj dozvole za korištenje životinja: PROTO202000002). Ova studija je u skladu s lokalnim zakonima, propisima i institucionalnim zahtjevima.
NG: Konceptualizacija, Kuriranje podataka, Formalna analiza, Istraživanje, Metodologija, Softver, Vizualizacija, Pisanje (originalni nacrt), Pisanje (pregled i uređivanje). LA: Konceptualizacija, Kuriranje podataka, Metodologija, Resursi, Pisanje (pregled i uređivanje). SH: Formalna analiza, Softver, Pisanje (pregled i uređivanje). SA: Istraživanje, Pisanje (pregled i uređivanje). Glavni sudija: Istraživanje, Pisanje (pregled i uređivanje). SN: Konceptualizacija, Administracija projekta, Resursi, Nadzor, Pisanje (pregled i uređivanje). TA: Konceptualizacija, Administracija projekta, Nadzor, Pisanje (pregled i uređivanje).
Autori izjavljuju da nisu primili nikakvu finansijsku podršku za istraživanje, autorstvo i/ili objavljivanje ovog članka.
Autori izjavljuju da je istraživanje provedeno u odsustvu bilo kakvih komercijalnih ili finansijskih odnosa koji bi se mogli protumačiti kao potencijalni sukob interesa. nije primjenjivo.
Sva mišljenja iznesena u ovom članku su isključivo mišljenja autora i ne odražavaju nužno stavove njihovih institucija, izdavača, urednika ili recenzenata. Izdavač ne garantuje niti podržava bilo koji proizvod ocijenjen u ovom članku, ili bilo kakve tvrdnje njihovih proizvođača.
Dodatni materijal za ovaj članak možete pronaći na internetu: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propionska kiselina indukuje gliozu i neuroinflamaciju regulisanjem PTEN/AKT puta kod poremećaja iz autističnog spektra. Naučni izvještaji 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Statistička analiza podataka o sastavu. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Odnos Firmicutes/Bacteroidetes kao faktor rizika za rak dojke. Časopis za kliničku medicinu, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Analiza diferencijalne ekspresije podataka o brojanju sekvenci. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Fekalni mikrobiot i metabolom kod djece s autizmom i pervazivnim razvojnim poremećajem koji nije drugačije specificiran. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Bakterijske neurometaboličke karakteristike crijevne mikrobiote kod male djece s poremećajima iz autističnog spektra. Časopis za medicinsku mikrobiologiju 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobiom kao ljudski organ. Klinička mikrobiologija i infekcija 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Novi uvidi u fiziologiju bakterija koje proizvode propionsku kiselinu: Anaerotignum propionicum i Anaerotignum neopropionicum (ranije Clostridium propionicum i Clostridium neopropionicum). Mikroorganizmi 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Ishrana majke i razvoj fetusa. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y. i Hochberg, J. (1995). Kontrola stope lažno pozitivnih rezultata: Praktičan i efikasan pristup višestrukom testiranju. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Vrijeme objave: 18. april 2025.