Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Za razliku od kičmenjaka, smatra se da insekti nemaju spolne steroidne hormone koji su dominantni kod mužjaka. Kod Anopheles gambiae, ekdizonski steroid 20-hidroksiekdizon (20E) izgleda da je evoluirao kako bi kontrolirao razvoj jaja kada ga sintetiziraju ženke2 i inducirao refraktorni period parenja kada ga mužjaci seksualno prenose3. Budući da su razvoj jaja i parenje bitne reproduktivne osobine, razumijevanje kako ženke komaraca Anopheles integriraju ove hormonske signale moglo bi olakšati dizajn novih programa za kontrolu malarije. Ovdje otkrivamo da su ove reproduktivne funkcije regulirane različitim spolnim steroidima putem složene mreže enzima koji aktiviraju/inaktiviraju ekdisteroide. Identificirali smo oksidirani ekdizon specifičan za mužjake, 3-dehidro-20E (3D20E), koji štiti roditeljstvo isključivanjem ženske seksualne receptivnosti nakon seksualnog prijenosa i aktivacije defosforilacijom. Značajno je da je prijenos 3D20E također inducirao ekspresiju reproduktivnih gena koji održavaju razvoj jaja tokom infekcije Plasmodiumom, osiguravajući zdravlje zaraženih ženki. Ženski 20E ne izaziva seksualni odgovor. ali omogućava jedinkama koje se pare da polažu jaja nakon što su inhibirane 20E-inhibirajuće kinaze. Identifikacija ovog muško-specifičnog insektnog steroidnog hormona i njegova uloga u regulaciji ženske seksualne receptivnosti, plodnosti i interakcije s Plasmodiumom sugerira potencijal za smanjenje reproduktivnog uspjeha komaraca koji prenose malariju.
Slučajevi i smrtni slučajevi od malarije ponovo su u porastu4 zbog široko rasprostranjene otpornosti na insekticide kod komaraca Anopheles, jedinog vektora ljudskih parazita malarije. Biologija parenja ovih komaraca posebno je atraktivna meta za nove intervencije kontrole malarije jer se ženke pare samo jednom5; sterilnost ovog pojedinačnog parenja imala bi veliki potencijal za smanjenje populacije komaraca na terenu.
Žene postaju seksualno onesposobljene nakon što prime visoke titre steroidnih hormona od muškaraca. Studije su pokazale da je okidač za poteškoće u daljnjem parenju 20-hidroksiekdizon (20E), steroidni hormon poznatiji kao regulator ciklusa mitarenja u larvalnoj fazi. Sposobnost mužjaka da sintetiziraju i prenose 20E evoluirala je specifično kod vrsta Anopheles koje su dio podroda Cellia7, koji je rasprostranjen u Africi i uključuje najopasnije vektore malarije, uključujući Anopheles gambiae. Ovo je posebno značajno jer kod ovih vrsta ženke također proizvode 20E nakon svakog obroka krvi, a 20E pokreće ciklus oogeneze (vidi ref. 8). Međutim, malo se zna o načinu na koji ženke integriraju signale iz dva različita izvora ekdizona (prijenos mužjaka i indukcija hranjenja krvlju) bez ugrožavanja vlastite sposobnosti parenja. U stvari, ako 20E koji proizvode ženke izazove seksualnu netoleranciju, to će dovesti do neplodnosti kod jedinki koje se hrane djevičanskim životinjama, što je vrlo uobičajeno ponašanje kod ovih komaraca5.
Moguće objašnjenje je da mužjaci A. gambiae prenose modificirani ekdizon specifičan za mužjake, koji aktivira signalnu kaskadu u ženskom reproduktivnom traktu, što rezultira nestabilnošću parenja. Međutim, iako kičmenjaci imaju više steroidnih hormona, poput estrogena i androgena (pregledano u ref. 9), koliko znamo, steroidi uzrokovani androgenima nisu identificirani kod insekata.
Krenuli smo u određivanje repertoara steroidnih hormona u muškoj pomoćnoj žlijezdi (MAG) spolno zrele A. gambiae u potrazi za mogućim modifikujućim steroidima. Korištenjem visokoefikasne tečne hromatografije u kombinaciji sa tandemskom masenom spektrometrijom (HPLC-MS/MS) umjesto manje specifične metode koja je prethodno korištena, detektovali smo ekdizon (E) i 20E u ovom tkivu, potvrđujući prethodni rezultat. Međutim, uzorkom su dominirali oksidovani fosforilovani steroidi, u skladu sa formulom 3-dehidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Slika 1). Drugi oblici uključuju 3-dehidro-20E (3D20E) i 20E-22-fosfat (20E22P). Intenzitet HPLC-MS/MS signala 3D20E22P bio je dva reda veličine veći od njegovog defosforilisanog oblika, 3D20E, i tri reda veličine veći od E i 20E (Slika 1). Iako su u drugim dijelovima tijela i donjem reproduktivnom traktu... (LRT; Prošireni podaci, slika 1a). Također smo analizirali ekdisteroide kod novozatvorenih (<1 dan starih) mužjaka i ženki i detektovali 3D20E i 3D20E22P samo u MAG; E, 20E i 20E22P bili su prisutni kod oba spola (Prošireni podaci, slika 1b). Ovi podaci ukazuju na to da odrasli mužjaci A. gambiae proizvode visoke titre modifikujućih hormona u svojim MAG-ovima koje ženke ne sintetiziraju.
MAG i ženski LRT (uključujući pretkomore, sjemene mjehuriće i parovarij) su disecirani od 4 dana starih (4 dana) djevičanskih mužjaka i djevičanskih i parenih ženki (0,5, 3 i 12 hpm). Ekdizon u ovim tkivima je analiziran HPLC-MS/MS (prosjek ± sem; nespareni t-test, dvostrani, korigovan za stopu lažnog otkrivanja (FDR); NS, nije značajno; *P < 0,05, **P < 0,01). 3D20E: 3 sata u odnosu na 0,5 sati, P = 0,035; 12 sati u odnosu na 3 sata, P = 0,0015; 12 sati u odnosu na 0,5 sati, P = 0,030. 3D20E22P: 3 sata u odnosu na 0,5 sati, P = 0,25; 12 sati u odnosu na 3 sata, P = 0,0032; 12 sati u odnosu na 0,5 sati, P = 0,015). Podaci su iz tri biološka ponavljanja. Površina vrha za svaki ekdizon od interesa izračunata je i normalizovana brojem komaraca. Ekdizon je predstavljen bojama na sljedeći način: E, zelena; 20E, narandžasta; 20E22P, ljubičasta; 3D20E, plava; 3D20E22P, ružičasta. Umetak povećava skalu na y-osi kako bi prikazao niže nivoe ekdizona.
Kako bismo istražili da li se 3D20E22P i 3D20E prenose tokom parenja, disecirali smo ženske LRT u različitim vremenskim tačkama nakon parenja. Iako ekdizon nije pronađen kod djevica, uočili smo značajne količine 3D20E22P u LRT odmah nakon parenja (0,5 h nakon parenja, hpm), koje su se vremenom smanjivale, dok su se nivoi 3D20E značajno povećavali (Slika 1). Koristeći hemijski sintetizirani 3D20E kao standard, utvrdili smo da su nivoi ovog steroidnog hormona u LRT tokom parenja bili najmanje 100 puta veći od 20E (Proširena tabela podataka 1). Dakle, 3D20E22P je glavni muški ekdizon koji se prenosi na ženski LRT tokom parenja, a njegov defosforilirani oblik, 3D20E, postaje veoma obilan ubrzo nakon parenja. Ovo ukazuje na važnu ulogu potonjeg ekdizona u biologiji ženki nakon parenja.
Nakon generiranja novog skupa podataka za sekvenciranje RNK (RNA-seq) (slika 2a), koristeći prilagođeni bioinformatički cjevovod, tražili smo ekdizon kinazu (EcK), ekdizon oksidazu (EO) i ekdizon koji kodira 20E-modificirani gen fosfataze. EPP) se eksprimira u reproduktivnim tkivima. Identificirali smo jednog kandidata za EPP gen i dva potencijalna EcK gena (EcK1 i EcK2), ali nismo uspjeli pronaći dobrog kandidata za EO gen. Značajno je da su pojedinačni EPP geni eksprimirani na visokim nivoima (98,9. percentil) u gambijskom MAG-u, ali ne i u ženskim LRT-ima (slika 2b), suprotno našim očekivanjima, budući da se defosforilacija 3D20E22P dogodila u ovom ženskom tkivu. Stoga vjerujemo da se muški EPP može prenijeti tokom parenja. Zaista, koristili smo in vivo označavanje stabilnim izotopima kako bismo maskirali ženski protein nakon parenja, enzim identificiran MS-om u ženskom atriju (slika 2c i Dodatna tabela 1). Prisustvo EPP kod MAG i parenih (ali ne djevičanskih) ženki LRT također je potvrđen korištenjem specifičnih antitijela (Slika 2d).
a, Prilagođeno izgrađen bioinformatički cjevovod za pretraživanje reproduktivnih tkiva svakog spola za gene koji kodiraju EcK, EO i EPP. Brojevi pored strelica označavaju broj muških i ženskih kandidata u svakom koraku. Ova analiza je identificirala jedan EPP gen (EPP) i jedan EcK gen (EcK1) koji se eksprimiraju kod mužjaka, te jedan EcK gen (EcK2) koji se eksprimira kod oba spola, ali ne daje kandidatski EO gen.b, Heatmap koji uspoređuje ekspresiju kandidatskih gena u djevičanskom (V) i parenju (M) tkivu Anopheles gambiae i Anopheles albicans. Spca, oplodnja; MAG, pomoćne žlijezde kod mužjaka; drugi dijelovi tijela, uključujući grudi, krila, noge, masna tijela i unutrašnje organe kod oba spola, te jajnike kod ženki. EcK2 je visoko eksprimiran i u MAG i u atrijima Gambije, dok se EPP nalazi samo u MAG.c, Proteomska analiza translokacije muške ejakulatne grupe u ženske atrije u 3, 12 i 24 hpm, pokazujući 67 najzastupljenijih proteina. Ženke su uzgajane na dijeti koja sadrži 15N za označavanje (i maskiranje) svih proteina. Neoznačeni mužjaci su pareni sa označenim ženkama, a ženske LRT su secirane u 3, 12 i 24 hpm za proteomsku analizu (pogledajte Dodatnu tabelu 1 za potpunu listu ejakulatornih proteina). Umetak, EPP, Eck1 i EcK2 su detektovani u MAG djevičanskih mužjaka proteomskom analizom ovih tkiva.d, EPP je detektovan Western blotom u MAG i LRT parenih ženki, ali ne kod djevičanskih ženki ili mužjaka ili ostatka ženskog tijela. Membrane su istovremeno ispitano anti-aktinskim (kontrola punjenja) i anti-EPP antitijelima. Svi mužjaci su djevici. Pogledajte Dodatnu sliku 1 za podatke o izvoru gela. Western blot je proveden dva puta sa sličnim rezultatima.
Aktivnost ekdisteroidne fosfofosfataze EPP-a potvrđena je nakon inkubacije HPLC-MS/MS-om sa 3D20E22P izolovanim iz MAG-a (Prošireni podaci, slika 2a). Nadalje, kada smo utišali EPP interferencijom posredovanom RNK (RNAi), otkrili smo snažno smanjenje aktivnosti fosfataze u reproduktivnim tkivima ovih mužjaka (slika 3a), a ženke parene sa mužjacima kojima je utišan EPP pokazale su značajno niži udio defosforiliranog 3D20E (slika 3b) uprkos djelimičnom utišavanju gena (Prošireni podaci, slika 2b,c). Nasuprot tome, nismo otkrili značajne promjene u omjeru 20E22P/20E kod istih komaraca, što bi moglo sugerirati da je enzim specifičan za 3D20E22P (slika 3b).
a, Smanjena aktivnost fosfataze u MAG uzrokovana utišavanjem EPP-a korištenjem kontrola dvolančane EPP RNA (dsEPP) ili dvolančane GFP RNA (dsGFP). Dvadeset MAG skupova korišteno je u svakom ponavljanju (P = 0,0046, parni t-test, dvostrani), predstavljenih odvojenim tačkama.b, Ženke parene s mužjacima s utišanim EPP-om imale su značajno niži udio defosforiliranog 3D20E pri 3 hpm (P = 0,0043, nespareni t-test, dvostrani), dok nivoi 20E nisu bili pogođeni (P = 0,063, nespareni). t-test, dvostrani). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna vrijednost iz tri grupe od po 13, 16 i 19 ženki.c, Ženke parene s mužjacima kojima je utišan EPP imale su značajno veće stope ponovnog parenja (P = 0,0002, Fisherov egzaktni test, dvostrani). Ženke su prvo bile prisiljene na parenje kako bi se osigurao njihov status parenja; Dva dana kasnije, kontaktirani su s drugim mužjacima koji su nosili transgenu spermu kako bi se procijenila stopa ponovnog parenja kvantitativnom PCR detekcijom transgena.d Ženke hranjene krvlju parene s mužjacima kojima je utišan EPP imale su značajno smanjenu plodnost (P < 0,0001; Mann-Whitneyjev test, dvostrani) i blago smanjen broj jaja (P = 0,088, Mann-Whitneyjev test, dvostrani), dok stopa mriještenja nije bila pogođena (P = 0,94, Fisherov egzaktni test, dvostrani). U svim panelima, n predstavlja broj biološki nezavisnih uzoraka komaraca.NS, nije značajno.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Zatim smo procijenili da li je defosforilacija ekdizona važna za indukovanje otpornosti na parenje kod ženki. Značajno je da su se ženke parile sa mužjacima kojima je smanjen nivo EPP-a ponovo parile u mnogo većoj učestalosti (44,9%) nego kontrolne ženke (10,4%) kada su bile izložene dodatnim (transgenim) mužjacima (slika 3c). Također smo primijetili značajno smanjenje plodnosti (slika 3d, lijevo) i blagi pad broja jaja koje su položile ove ženke (slika 3d, sredina), dok procenat jaja koje su položile ženke (još jedan odgovor izazvan kod ženki parenjem) nije bio pogođen (slika 3d, desno). S obzirom na uočenu specifičnost EPP-a za 3D20E22P, ovi rezultati sugeriraju da aktivacija 3D20E putem EPP-a prenesenog tokom parenja može imati važnu ulogu u isključivanju ženske receptivnosti za dalje parenje, ponašanje koje se ranije pripisivalo seksualnom prijenosu 20E. Stoga, ovaj hormon specifičan za mužjake također snažno utiče na žensku plodnost.
Zatim smo uporedili aktivnosti 20E i 3D20E u eksperimentima injekcije kod spolno zrelih djevica koristeći hemijski sintetizirani 3D20E (Slika 4a-c) i komercijalno dostupan 20E. Uočili smo da je 3D20E bio značajno efikasniji od 20E u isključivanju osjetljivosti ženki na parenje pri obje koncentracije (Slika 4d). Značajno je da je polovina fiziološkog nivoa 3D20E u LRT (1.066 pg nakon injekcije u odnosu na 2.022 pg nakon parenja) izazvala udio refraktornih ženki koji je bio 20 puta veći od fiziološkog nivoa 20E (361 pg nakon injekcije) 24 sata nakon injekcije pri najvišoj koncentraciji od 18 pg nakon parenja; Prošireni podaci (Tabela 1). Ovaj rezultat je u skladu s idejom da seksualni prijenos 20E ne uzrokuje refraktorne periode parenja i dodatno ukazuje na 3D20E kao glavni faktor u osiguravanju odnosa roditelj-dijete. 3D20E je također bio značajno aktivniji od 20E u testovima polaganja jaja kod ženki koje nisu rodile (Slika 4e), što sugerira da je normalna stopa polaganja jaja koju smo primijetili nakon djelomičnog utišavanja EPP-a bila posljedica prisustva rezidualne 3D20E aktivnosti koju i dalje proizvode faktori izazvani parenjem kod ženki.
(a,b) 3D20E hemijski sintetiziran iz 20E (a) sa vrlo visokom konverzijom/efikasnošću (podaci prikazani kao srednja vrijednost ± standardna vrijednost iz tri nezavisne reakcije sinteze) (b).c, Maseni spektar (donja polovina) tačno se podudara sa ekdizonom pronađenim u parenim ženkama LRT (gornja polovina).d, U poređenju sa 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherov egzaktni test, dvostrani) i 10% etanolom (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherov egzaktni test, dvostrani), dok je 20E bio značajno veći od kontrole samo pri višim dozama (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fisherov egzaktni test, dvostrani).e, Injekcija 3D20E je značajno izazvala veće stope mriještenja kod djevičanskih ženki u odnosu na kontrole s 10% etanola (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisherov egzaktni test, dvostrani), dok je 20E u poređenju s kontrolama samo pri višim dozama (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisherov egzaktni test, dvostrani). 3D20E je izazvao značajno veće stope mriještenja od 20E pri višim dozama (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisherov egzaktni test, dvostrani). U svim panelima, n predstavlja broj biološki nezavisnih uzoraka komaraca. NS, nije značajno. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Podaci su iz tri... replicira.
U prethodnim studijama utvrdili smo da seksualni prijenos steroidnih hormona inducira ekspresiju MISO-a (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), ženskog reproduktivnog gena koji štiti ženke A. gambiae od infekcije P. falciparum. Zdravstveni troškovi uzrokovani 13, najsmrtonosnijim ljudskim parazitom malarije. S obzirom na važnost MISO-a za reproduktivnu sposobnost Anophelesa u područjima endemskim za malariju, odlučili smo utvrditi koji hormon 3D20E ili 20E pokreće ekspresiju ovog gena. Otkrili smo da, iako injekcija 20E specifično ili potentnije inducira neke nuklearne hormonske receptore (HR), kao što su HR3 i HR4, i tipične nizvodne steroidne ciljeve, kao što su yolkogeni geni Vg14, 15, 16, MISO je jače induciran od strane 3D20E (Prošireni podaci, slika 3). Dakle, čini se da seksualni prijenos ovog androgenog steroidnog hormona inducira mehanizme koji štite ženke od troškova koje predstavlja parazitska infekcija. Nadalje, 3D20E različito utječe na obje izoforme E receptor EcR, indukujući EcR-A i potiskujući EcR-B, te snažnije aktivirajući druge gene koji induciraju parenje, uključujući HPX15, koji utječe na žensku plodnost. Ovo bi moglo objasniti značajnu neplodnost uočenu kod ženki parenih s mužjacima kojima je utišan EPP (Prošireni podaci, slika 3). Ovi podaci ukazuju na postojanje nizvodnih puteva preferencijalno aktiviranih dvama ekdizonskim hormonima koji mogu biti u osnovi spolno specifične funkcije.
Zatim smo testirali funkciju dva EcK gena identificirana u našem bioinformatičkom cjevovodu. Utišavanje EcK1 ili EcK2 rezultiralo je značajnom smrtnošću kod mužjaka (Prošireni podaci, slika 4a), što sugerira da je fosforilacija ekdizona, a time i inaktivacija, važna za preživljavanje. Budući da je EcK2 eksprimiran na višim nivoima od EcK1 i detektovan je u MAG-ovima proteomikom (slika 2b,c i dodatna tabela 2), validirali smo njegovu aktivnost ekdisteroid kinaze inkubacijom sa 20E, što je rezultiralo fosforilacijom 20E22P (Prošireni podaci, slika 2).4b). Kada smo koristili 3D20E kao supstrat, nismo mogli detektovati fosforilirani produkt 3D20E22P (Prošireni podaci, slika 4c), što sugerira da bi 20E, a ne 3D20E, mogao biti preferirana meta EcK2.
Prema našoj RNA-sekvencionoj analizi, EcK2 je također bio visoko eksprimiran u LRT-u djevičanskih ženki, gdje je bio isključen nakon parenja (Sl. 2b). Potvrdili smo ove podatke i utvrdili da ekspresija EcK2 nije bila pod utjecajem hranjenja krvlju (Prošireni podaci, Sl. 5a). Proširujući naše početne MS eksperimente, utvrdili smo da je vrh 20E22P usko povezan s vrhom 20E (22-26 sati nakon obroka krvi; Prošireni podaci, Sl. 5b). Utišavanje EcK2 kod djevičanskih ženki rezultiralo je trostrukim povećanjem relativnog omjera 20E i 20E22P 26 sati nakon obroka krvi (Prošireni podaci, Sl. 2c i 5c), potvrđujući da EcK2 također fosforilira 20E kod ženki. Značajno je da su djevičanske ženke kojima je smanjen nivo EcK2 zadržale punu seksualnu receptivnost (Prošireni podaci, Sl. 5d,e), što dodatno sugerira da proizvodnja 20E kod ženki ne inducira refraktorne periode parenja. Međutim, ove ženke su imale značajno... povećane stope polaganja jaja u poređenju s kontrolnom grupom, s više od 30% djevica koje su položile jaja (Prošireni podaci, slika 5f). Ako su injekcije dvolančane Eck2 RNK (dsEcK2) izvršene nakon hranjenja krvlju, mrijest se nije dogodio, u kom trenutku je vrh 20E zbog gutanja krvi opao. Sveukupno, ovi rezultati podržavaju model da 20E proizveden nakon sisanja krvi može izazvati mrijest, ali samo kada se blokada mrijesta (EcK2 i moguće drugi faktori) isključi parenjem. Ni injekcije 20E ni 3D20E nisu inhibirale ekspresiju EcK2 kod djevica (Prošireni podaci, slika 5g), što sugerira da drugi faktori posreduju u inhibiciji ove kinaze. Međutim, nivoi 20E nakon hranjenja krvlju nisu bili dovoljni da izazovu nelagodu pri parenju, već su ih efikasno izazvali visoki titri seksualno prenesenog 3D20E.
Naši rezultati pružaju važan uvid u mehanizme koji regulišu reproduktivni uspjeh A. gambiae. Pojavio se model u kojem su mužjaci evoluirali da sintetiziraju visoke titre 3D20E, muško-specifičnog modificiranog ekdizona koji osigurava roditeljstvo desenzibilizacijom ženki na daljnje parenje. Istovremeno, ovi vektori malarije su također razvili efikasan sistem za aktiviranje 3D20E kod ženki kao odgovor na seksualni prijenos mužjački specifičnog EPP-a. Koliko znamo, ovo je prvi primjer steroidnog hormonskog sistema kojim dominiraju mužjaci i ženke, a koji obavlja jedinstvenu i kritičnu funkciju kod insekata. Funkcija muško-specifičnog ekdizona je postulirana, ali nije definitivno dokazana. Na primjer, uglavnom opovrgnuta hipoteza 18 je da ove funkcije može obavljati 20E prekursor E1. Dobro je poznato da se kod Drosophile monandrija pokreće seksualnim prijenosom malih spolnih peptida 19,20 koji interaguju s neuronima koji inerviraju ženski reproduktivni trakt putem specifičnih receptora spolnih peptida 21,22. Potreban je daljnji rad kako bi se odredile nizvodne signalne kaskade. kontrolirano pomoću 3D20E kod ženki A. gambiae i utvrditi mogu li se ove kaskade očuvati između komaraca i Drosophila.
S obzirom na važnu ulogu 3D20E na plodnost i ponašanje ženki identifikovanu u našoj studiji, putevi koji vode do sinteze i aktivacije 3D20E nude nove mogućnosti za buduće strategije kontrole komaraca, kao što je generisanje konkurentnih sterilnih mužjaka u strategijama sterilne tehnologije insekata koji se koriste za puštanje u divljinu ili za imitaciju 3D20E u igri bez roditelja. Funkcija 3D20E specifična za mužjake možda se razvila kada su A. gambiae i druge vrste Cellia stekle sposobnost koagulacije svoje sperme u čepove za parenje, jer to omogućava efikasan prenos velikog broja hormona i enzima koji aktiviraju hormone. Zauzvrat, evolucija 3D20E koja implementira monandriju pruža mehanizam za ženke (kroz visoku ekspresiju MISO) da favorizuje svoju reproduktivnu sposobnost u područjima sa visokom prevalencijom malarije, što indirektno doprinosi prenosu Plasmodiuma. S obzirom na to da je pokazano da ženski 20E ima dubok uticaj na preživljavanje i rast P. falciparum kod ženki komaraca Anopheles,24 i muški i ženski putevi steroidnih hormona sada su ključni aspekti interakcija komaraca i parazita.
Sojevi A. gambiae G3 uzgajani su pod standardnim uvjetima za insekte (26-28 °C, 65-80% relativne vlažnosti, 12:12 sati fotoperioda svjetla/tame). Larve su hranjene hranom za ribe u prahu (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets i Tetra Pond Sticks u omjeru 7:7:2). Odrasli komarci hranjeni su ad libitum 10% otopinom dekstroze i sedmično ljudskom krvlju (komponente krvi za proučavanje). Djevičanski komarci dobiveni su odvajanjem spolova u fazi kukuljice nakon pregleda krajeva mikroskopijom. Mužjaci koji nose DsRed transgen opisani su ranije.
Eksperimenti prisilnog parenja provedeni su prema prethodno opisanim protokolima. Za prirodno parenje, ženke stare 4 dana držane su u omjeru 1:3 sa spolno zrelim mužjacima, koji nisu bili spolno zreli, tokom dvije noći. Za eksperimente u kojima je mužjacima ubrizgan dsEPP, zajednički smještaj u kavezu poklopio se sa 3-4 dana nakon injekcije, kada je aktivnost fosfataze bila maksimalno utišana (Prošireni podaci, slika 2b).
Tkiva komaraca, preostali leševi (ostatak tijela) ili cijelo tijelo secirani su u 100% metanolu i homogenizirani pomoću kuglice (staklene kuglice od 2 mm, 2.400 rpm, 90 sekundi). Količine tkiva i volumeni metanola bili su sljedeći: ostatak tijela, 50 u 1.000 µl; MAG, 50–100 po 80 µl; ženski LRT, 25–50 po 80 µl. Talog je podvrgnut drugoj ekstrakciji metanolom s istim volumenom metanola. Ćelijski ostaci su uklonjeni centrifugiranjem. Metanol iz obje ekstrakcije je spojen i osušen pod protokom dušika, a zatim resuspendiran u sljedećim volumenima 80% metanola u vodi: ostatak tijela, 50 µl; MAG i ženski LRT, 30 µl.
Uzorci su analizirani na masenom spektrometru (ID-X, Thermo Fisher) spojenom na LC instrument (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl uzorka je injektirano na kolonu od 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) održavanu na 25 °C. Mobilne faze za LC bile su A (voda, 0,1% mravlja kiselina) i B (acetonitril, 0,1% mravlja kiselina). LC gradijent je bio sljedeći: 5% B tokom 1 minute, zatim povećan na 100% B tokom 11 minuta. Nakon 8 minuta na 100%, kolona je ponovo uravnotežena na 5% B tokom 4 minute. Brzina protoka je bila 0,3 ml min-1. Ionizacija u MS izvoru se postiže zagrijavanjem elektrosprej ionizacijom u pozitivnom i negativnom modu.
Maseni spektrometar mjeri podatke u m/z rasponu od 350 do 680 pri rezoluciji od 60.000 u punom MS modu. MS/MS podaci su prikupljeni na [M + H]+ (svi ciljevi), [M - H2O + H]+ (svi ciljevi) i [M - H]- (fosforilirani ciljevi). MS/MS podaci su korišteni za potvrdu ekdizonskih svojstava ciljeva za koje nije bio dostupan standard. Za identifikaciju neciljanih ekdisteroida, analizirani su MS/MS podaci za sve HPLC vrhove sa >15% relativne količine. Kvantificirajte korištenjem standardnih krivulja kreiranih od čistih standarda (20E, 3D20E) za izračunavanje apsolutnih količina ili razrjeđenja jednog specifičnog uzorka (svi ostali ciljevi) za izračunavanje njihove ekvivalentnosti količinama pronađenim kod jednog mužjaka. Za 3D20E, kvantifikacija je izvršena korištenjem sume sljedećih adukata: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Podaci su ekstrahovani i kvantifikovani pomoću programa Tracefinder (verzija 4.1). MS/MS podaci su analizirani pomoću programa Xcalibur (verzija 4.4). MS spektri E, 20E i 3D20E su upoređeni sa odgovarajućim standardima. 3D20E22P je analiziran derivatizacijom sa Girardovim reagensom. 20E22P je analiziran pomoću m/z odnosa.
3D20E22P je pročišćen iz MAG-a. Pročišćavanje je provedeno na analitičkoj skali korištenjem ultra-performansnog tečnog hromatografa (Acquity, Waters) sa kvadrupolnim detektorom baziranim na masi (QDa, Acquity, Waters) pod istim LC uslovima kao i HPLC-MS/MS analiza. Sakupljanje frakcija je pokrenuto kada je m/z koji odgovara 3D20E22P detektovan u istom vremenu zadržavanja kao što je prethodno određeno. Čistoća ekstrahovanih jedinjenja je zatim provjerena HPLC-MS/MS kao što je gore opisano.
Ukupna RNK je ekstrahovana iz 10-12 reproduktivnih tkiva ili drugih dijelova tijela (bez glave) korištenjem TRI reagensa (Thermo Fisher) prema uputama proizvođača. RNK je tretirana sa TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNK je sintetizirana korištenjem reverzne transkriptaze Moloney mišjeg leukemijskog virusa (M-MLV RT; Thermo Fisher) prema uputama proizvođača. Prajmeri za kvantitativnu PCR reverzne transkripcije (RT-qPCR; Proširena tabela podataka 2) su prethodno objavljeni24 ili dizajnirani korištenjem Primer-BLAST26, s prednošću za proizvode veličine 70-150 bp i koji obuhvataju spojeve egzon-egzon ili parove prajmera koji odvajaju egzone. Uzorci cDNK iz tri do četiri biološka replikata su razrijeđeni četiri puta u vodi za RT-qPCR. Kvantifikacija je provedena u reakcijama replikata od 15 µl koje sadrže 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), prajmere i 5 µl razrijeđene cDNK. Reakcije su provedene na QuantStudio 6 Pro real-time PCR sistemu (Thermo Fisher) i podaci su prikupljeni i analizirani korištenjem programa Design and Analysis (verzija 2.4.3). Kao što je pokazano u ovoj studiji, relativne količine su normalizovane na ribosomski gen RpL19 (AGAP004422), čija se ekspresija nije značajno mijenjala sa hranjenjem krvlju 27 ili parenjem 3.
Kvalitet RNK provjeren je korištenjem Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer-a (Agilent). Illumina biblioteke sparenih krajeva pripremljene su i pokrenute na Broad institutu MIT-a i Harvarda. Sekvencirajući očitavanja su poravnata s genomom A. gambiae (PEST soj, verzija 4.12) korištenjem HISAT2 (verzija 2.0.5) s zadanim parametrima. Očitavanja s rezultatima kvalitete mapiranja (MAPQ) <30 uklonjena su korištenjem Samtools-a (verzija 1.3.1). Broj očitavanja mapiranih na gene prebrojan je korištenjem htseq-count (verzija 0.9.1) s zadanim parametrima. Normalizirani broj očitavanja izračunat je, a diferencijalna ekspresija gena analizirana korištenjem DESeq2 paketa (verzija 1.28.1) u R-u (verzija 4.0.3).
Kandidati za gene koji modificiraju ekdizon identificirani su prvo pretraživanjem genoma A. gambiae korištenjem PSI-BLAST algoritma (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), korištenjem zadanih vrijednosti parametara sa sljedećim sekvencama upitnih proteina: iz Bombyx mori (pristupni broj NP_001038956.1), Musca domestica (pristupni broj XP_005182020.1, XP_005175332.1 i XP_011294434.1) i Microplitis demolitor (pristupni broj XP_008552646.1 i XP_008552645.1) EcK iz B. mori (pristupni broj NP_001036900), Drosophila melanogaster (pristupni broj NP_651202), Apis mellifera (Pristupni broj XP_394838) i Acyrthosiphon pisum (Pristupni broj XP_001947166); i EPP od B. mori (Pristupni broj XP_001947166) NP_001177919.1 i NP_001243996.1) i EO od D. melanogaster (Pristupni broj NP_572986.1) (korak 1). Zatim, filtrirajte pogotke na osnovu visoke ekspresije mRNA (>100 fragmenata/kilobaznih eksona na milion mapiranih očitavanja (FPKM) ili >85%) u reproduktivnom tkivu (ženski LRT ili MAG) u Gambiji (korak 2). Kako bismo poboljšali specifičnost, odabrali smo kandidatske enzime koji se također eksprimiraju u reproduktivnom tkivu A. albimanus, vrste Anopheles koja ne sintetizira niti prenosi ekdizon tokom parenja. Kandidatski geni su filtrirani na osnovu niske ekspresije (<100 FPKM ili <85. percentil) u reproduktivnom tkivu A. albimanus (korak 3). Kao konačni filter (korak 4), kandidatski geni moraju zadovoljiti barem jedan od sljedećih uslova: (1) značajno pojačana ekspresija nakon parenja (P < 0,05) prema analizi različito eksprimiranih gena i (2) u nereproduktivnim tkivima (< 85 % ili <100 FPKM).
Modificirali smo prethodno opisane metode 28,29,30 kako bismo postigli izotopsko označavanje cijelog organizma. Ukratko, divlji tip Saccharomyces cerevisiae tipa II (YSC2, Sigma) testiran je u kvascu s dušičnom bazom (BD Difco, DF0335) koja sadrži (wt/vol) 2% glukoze (G7528, Sigma), 1,7% medija za kulturu bez aminokiselina i amonijum sulfata i 5% 15N amonijum sulfata (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) kao jedini izvor dušika. Kvasac je izoliran centrifugiranjem, a larve komaraca su hranjene ad libitum do ukukuljitve. Dodatak je riblje brašno (0,5 mg na 300 larvi) kako bi se spriječila smrtnost u četvrtom stadiju. Zatim su u eksperimentima parenja s neobilježenim mužjacima korištene samo ženke za analizu muškog proteoma prenesenog tokom parenja.
Djevice ženke stare 4-6 dana, označene sa 15N, bile su prisiljene da se pare sa neoznačenim djevičanskim mužjacima iste dobi. Uspješno parenje je potvrđeno detekcijom parenja pod epifluorescentnom mikroskopijom. U 3, 12 i 24 sata u minuti, pretkomore 45-55 parenih ženki su disecirane u 50 µl amonijum bikarbonatnog pufera (pH 7,8) i homogenizovane tučkom. Homogenat je centrifugiran, a supernatant pomiješan sa 50 µl 0,1% RapiGest-a (186001860, Waters) u 50 mM amonijum bikarbonata. Supernatant i talog iz svakog uzorka su brzo zamrznuti na suvom ledu i preko noći poslani u MacCoss laboratoriju na Univerzitetu u Washingtonu, gdje je završena priprema uzorka za LC-MS/MS. Talog je resuspendovan u 50 µl 0,1% RapiGest-a u 50 mM amonijum bikarbonata i sonikovan u vodenoj kupelji. Koncentracija proteina u talogu i supernatantu je mjerena BCA metodom. U testu, uzorci su reducirani sa 5 mM ditiotreitola (DTT; Sigma), alkilirani sa 15 mM jodoacetamida (Sigma) i inkubirani na 37 °C (1:0 50) tokom 1 sata sa omjerom tripsinizacije:tripsin:supstrat). RapiGest je liziran dodavanjem 200 mM HCl, nakon čega je uslijedila inkubacija na 37 °C tokom 45 minuta i centrifugiranje na 14.000 rpm tokom 10 minuta na 4 °C radi uklanjanja ostataka. Uzorci su isprani dvostrukom ekstrakcijom na čvrstoj fazi (Oasis MCX patrone, Waters) i resuspendirani u 0,1% mravljoj kiselini do konačne koncentracije proteina od 0,33 µg µl-1. Neobilježeni MAG proteomi su slično analizirani od djevičanskih mužjaka. Dva analitička ponavljanja su analizirana za svaki uzorak. Zatim je 1 µg svakog analiziran korištenjem 25-cm kolone od fuzioniranog silicijum dioksida 75 μm sa 4-cm... Trapka od fuzioniranog silicijum dioksida Kasil1 (PQ) napunjena reverzno-faznom smolom Jupiter C12 (Phenomenex) i tečna hromatografija u trajanju od 180 minuta. Digestije uzoraka – MS/MS je proveden na Q-Exactive HF masenom spektrometru (Thermo Fisher) s nanoACQUITY UPLC sistemom (Waters). Podaci o akviziciji generirani za svaki pokus pretvoreni su u mzML format korištenjem Proteowizard-a (verzija 3.0.20287) i korištenjem Comet31 (verzija 3.2) u odnosu na FASTA bazu podataka koja sadrži proteinske sekvence iz Anopheles gambiae (VectorBase verzija 54), Anopheles coluzzi. Pretraga je izvršena na Mali-NIH (VectorBase verzija 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, mart 2021), A. gambiae RNA-seq i translacijama s tri okvira poznatih ljudskih kontaminanata. FDR-ovi usklađeni s peptidnom mapom određeni su korištenjem Percolator32 (verzija 3.05) s pragom od 0,01, a peptidi su sastavljeni u identifikacijske podatke proteina korištenjem protein parsimony u Limelight33 (verzija 2.2.0). Relativna abundancija proteina procijenjena je korištenjem normaliziranog faktora spektralne abundancije (NSAF) izračunatog za svaki protein u svakom pokusu kao što je prethodno opisano. NSAF u odnosu na svaki protein usrednjen je na uzorcima iz dva različita biološka ponavljanja. Označavanje sa 15N uspješno je maskiralo ženski proteom, iako se mala količina neobilježenog proteina mogla detektovati iz obilježenih djevičanskih uzoraka. Zabilježili smo detekciju redukcije muških proteina (1-5 spektri) u sirovim ženskim uzorcima samo u tehničkim pokusima, gdje su sirovi uzorci analizirani nakon muških/parećih uzoraka, kao rezultat HPLC "prenošenja". Povremeni proteini pronađeni kao "kontaminanti" iz obilježenih djevičanskih uzoraka navedeni su u Dodatnoj tabeli 1.
Dva antigena peptida, QTTDRVAPAPDQQQ (unutar izotipa PA) i MESDGTTPSGDSEQ (unutar izotipa PA i PB) u Genscriptu. Dva peptida su kombinovana, zatim konjugovana sa proteinom nosačem KLH i injektirana u novozelandske zečeve. Zečevi su žrtvovani nakon četvrte injekcije, a ukupni IgG je izolovan afinitetnim pročišćavanjem. IgG od zeca sa najspecifičnijim EPP-om je korišten za dalje Western blot testiranje.
Za Western blot, MAG (n = 10, gdje n predstavlja broj biološki nezavisnih uzoraka komaraca) i ženke LRT (n = 30) od 4 dana starih djevičanskih mužjaka i djevičanskih ili prisilno parenih ženki (<10 nakon parenja), pufer za ekstrakciju proteina (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% natrijum deoksiholat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× koktel inhibitora proteaze (Roche)) je dodan odvojeno. Uzorci su homogenizovani odmah nakon disekcije pomoću kuglice (2 mm staklene kuglice, 2.400 rpm, 90 sekundi). Nerastvorljivi ostaci su uklonjeni centrifugiranjem na 20.000 g na 4 °C. Proteini su kvantifikovani Bradford testom (Bio-Rad). Zatim je 20 µg MAG proteina, 40 µg LRT proteina i 20 µg rezidualnog proteina denaturisano i odvojeno sa 10%. Bis-Tris NuPAGE korištenjem MOPS pufera. Proteini su preneseni na poliviniliden fluoridne membrane korištenjem iBlot2 transfer sistema (Thermo Fisher). Membrane su isprane dva puta u 1× PBS-T (0,1% Tween-20 u PBS-u), a zatim blokirane u Odyssey puferu za blokiranje (Li-Cor) tokom 1 sata na 22°C. Membrane su protresene preko noći na 4°C sa prilagođenim zečjim anti-EPP poliklonskim primarnim antitijelom (1:700 u puferu za blokiranje) i pacovskim anti-aktinskim monoklonskim primarnim antitijelom MAC237 (Abeam; 1:4.000). Membrane su isprane sa PBS-T, a zatim inkubirane sa sekundarnim antitijelima (magareće anti-zečje 800CW i kozje anti-pacovsko 680LT (Li-Cor), oba 1:20.000) u puferu za blokiranje koji sadrži 0,01% SDS i 0,2% Tween -20 tokom 1 sata na 22°C. Membrane su isprane sa PBS-T. i snimljene Odyssey CLx skenerom. Slike su prikupljene i obrađene u Image Studio (verzija 5.2). Specifična traka koja odgovara EPP-RA izoformi (82 kDa) nije detektovana.
Kodirajući regioni EPP-a (kao izoforma AGAP002463-RB koja sadrži domen histidin fosfataze, NCBI pretraga konzerviranog domena 34) i EcK2 (AGAP002181) klonirani su u plazmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); prajmeri su navedeni u Proširenoj tabeli podataka 2. Osam GS4 linkera (u tandemu) umetnuto je prije C-terminalne 6xHis oznake konstrukta pET-21a(+)-EcK2. Rekombinantni proteini su proizvedeni korištenjem NEBExpress reakcije sinteze proteina E. coli bez ćelija (New England BioLabs). Rekombinantni proteini su pročišćeni korištenjem NEBExpress Ni spin kolona (New England BioLabs). Kontrolni protein dihidrofolat reduktaze (DHFR) proizveden je korištenjem DNK predloška iz NEBExpress Cell-Free E. coli kompleta za sintezu proteina. Proteini su čuvani u 50% glicerolu u PBS-u na -20 °C do 3 mjeseca.
Fosfatazna aktivnost EPP-a i ekstrakata tkiva mjerena je korištenjem 4-nitrofenil fosfata (pNPP; Sigma-Aldrich). Reakcijski pufer sadržavao je 25 mM Tris, 50 mM sirćetne kiseline, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA i 1 mM DTT. Tkivo je homogenizirano u reakcijskom puferu, a ostaci ćelija uklonjeni su centrifugiranjem. Reakciju započeti dodavanjem enzima ili ekstrakta tkiva u reakcijski pufer koji sadrži 2,5 mg ml-1 pNPP. Reakcijska smjesa inkubirana je na sobnoj temperaturi u mraku, a količina pNP pretvorenog iz pNPP kvantificirana je mjerenjem apsorbancije na 405 nm u različitim vremenskim periodima.
Za in vitro EcK aktivnost, protein je inkubiran sa 0,2 mg 20E ili 3D20E u 200 µl pufera (pH 7,5) koji sadrži 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP i 10 mM MgCl2 tokom 2 sata na 27 °C. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 800 µl metanola, zatim ohlađena na -20 °C tokom 1 sata, a potom centrifugirana na 20.000 g tokom 10 minuta na 4 °C. Supernatant je zatim analiziran HPLC-MS/MS. Da bi se proteini korišteni u kontrolnoj grupi inaktivirali toplotom, proteini su inkubirani u 50% glicerolu u PBS-u tokom 20 minuta na 95 °C.
Za in vitro EPP aktivnost, protein je inkubiran sa 3D20E22P (ekvivalentno količini pronađenoj u 18 parova MAG, pročišćenih HPLC-MS/MS) u 100 µl pufera (pH 7,5) koji sadrži 25 mM Tris, 50 mM sirćetne kiseline, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA i 1 mM DTT tokom 3 sata na 27 °C. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 400 µl metanola i hlađena na -20 °C tokom 1 sata, a zatim centrifugirana na 20.000 g tokom 10 minuta na 4 °C. Supernatant je analiziran HPLC-MS/MS.
PCR fragmenti za EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) i EcK2 (556 bp) su amplificirani iz cDNA pripremljene iz leševa komaraca miješanog spola bez glava. PCR fragment eGFP kontrole (495 bp) je amplificiran iz prethodno opisanog pCR2.1-eGFP; PCR prajmeri su navedeni u Proširenoj tabeli podataka 2. PCR fragment je umetnut između invertovanih T7 promotora na plazmidu pL4440. Plazmidne konstrukcije su dobijene iz NEB 5-α kompetentne E. coli (New England Biolabs) i verifikovane sekvenciranjem DNK prije upotrebe (vidi Dodatne podatke 1 za sekvencu inserta). Prajmeri koji se podudaraju sa T7 promotorom (Proširena tabela podataka 2) korišteni su za amplifikaciju inserta iz plazmida baziranog na pL4440. Veličina PCR produkta potvrđena je elektroforezom na agaroznom gelu. dsRNA je transkribovana iz PCR predložaka korištenjem Megascript T7 transkripcijskog kompleta (Thermo Fisher) i pročišćena prema uputama proizvođača uz prethodno opisane modifikacije.
Za injekciju dsRNA, 1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) je injektirano u koncentraciji od 10 ng nl-1 u toraks odraslih mužjaka ili ženki (Nanoject III, Drummond) unutar 1 dana nakon ekloze. Nivoi smanjenja gena određeni su u najmanje tri biološka ponavljanja ekstrakcijom RNK, sintezom cDNA i RT-qPCR. Za injekciju ekdizona, ženkama starim 4 dana ili 6 dana, hranjenim krvlju, injektirano je 0,13, 0,21 ili 0,63 µg 20E ili 3D20E (Nanoject III, Drummond) u koncentracijama od 1,3, 2,1, respektivno, ovisno o eksperimentalnom dizajnu ili 6,3 ng nl-1. Injektirano je 100 nl 10% (vol/vol) etanola u vodi; 100 nl 3D20E22P u 10% etanolu (ekvivalentno 75% količine pronađene u paru MAG-ova). Komarci su nasumično raspoređeni u grupu koja je primala injekciju.
Za testove mrijesta, ženke stare 3 dana hranjene su ad libitum ljudskom krvlju. Uklonite djelomično hranjene ili neuhranjene komarce. Ovisno o tretmanu, ženke su smještene u odvojene posude za mrijest četiri noći najmanje 48 sati nakon obroka krvi. Jaja su brojana pod stereoskopom (Stemi 508, Zeiss); kod parenih ženki, jaja koja su se izlegla u larve smatrana su oplođenim.
Za pokuse parenja, ženkama je dozvoljeno najmanje 2 dana, ovisno o tretmanu, da razviju otpornost na parenje, a mužjaci divljeg tipa odgovarajuće dobi naknadno su ubačeni u isti kavez. Dvije noći kasnije, oplođene vezikule ženki su disecirane, a genomska DNK je oslobođena zamrzavanjem-odmrzavanjem i sonikacijom u puferu koji sadrži 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA i 25 mM NaCl (pH 8,2). Uzorci su inkubirani s Proteinazom K (0,86 µg µl-1) tokom 15 minuta na 55 °C, a zatim 10 minuta na 95 °C. Preparati sirove genomske DNK su razrijeđeni 10 puta i podvrgnuti qPCR detekciji sekvenci Y hromosoma; prajmeri su navedeni u Proširenoj tabeli podataka 2. Odsustvo sekvence Y hromosoma ukazuje na to da nema parenja.
Za testove ponovnog parenja, ženke koje su bile prisilno sparene pregledane su na prisustvo parenja kako bi se potvrdio status parenja i ostavljeno im je 2 dana da razviju otpornost na parenje u odsustvu mužjaka, kao što je prethodno opisano 36. Mužjaci koji su nosili DsRed transgenu spermu zatim su ubačeni u kaveze ženki. Dvije noći kasnije, vezikule za oplodnju su secirane iz ženki, a genomska DNK je pripremljena kao što je gore opisano i podvrgnuta qPCR detekciji DsRed transgena; prajmeri su navedeni u Proširenoj tabeli podataka 2. Odsustvo DsRed transgena ukazuje na to da nije došlo do ponovnog parenja.
3D20E je sintetiziran kako je prethodno opisano 37. Ukratko, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) je rastvoreno u 10 ml vode, nakon čega je dodano 30 mg platinaste crne boje (u obliku praha, Sigma-Aldrich). Slab mlaz O2 je kontinuirano propuštan u reakcijsku smjesu, koja je miješana na sobnoj temperaturi. Nakon 6 sati, dodano je 30 mL metanola da bi se zaustavila reakcija. Smjesa je centrifugirana da bi se uklonile čestice katalizatora. Supernatant je uparen do suhog u vakuumu na sobnoj temperaturi. Osušeni reakcijski produkt je rastvoren u 10% etanolu i metanolu za injekcije za HPLC-MS/MS analizu. Stopa konverzije (od 20E do 3D20E) bila je približno 97% (slika 4b), a MS spektar sintetiziranog 3D20E odgovarao je onome pronađenom kod parenih ženki (slika 4c).
Legenda sadrži specifične detalje provedenih statističkih testova. GraphPad (verzija 9.0) korišten je za izvođenje Fisherovog egzaktnog testa, Mantel-Cox testa i Studentovog t-testa. Cochran-Mantel-Haenszel testovi su provedeni korištenjem prilagođenog R skripta (dostupnog na https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Distribucija podataka je testirana na normalnost korištenjem Shapiro-Wilk testa s pragom značajnosti od 0,05. Kada podaci nisu prošli test normalnosti, proveden je Mann-Whitneyjev test. Podaci o preživljavanju su analizirani korištenjem Mantel-Cox testa. DESeq2 paket (verzija 1.28.1) korišten je za izvođenje analize diferencijalne ekspresije na nivou gena RNA-seq. Horizontalna traka na grafikonu predstavlja medijan. Vrijednost značajnosti od P = 0,05 korištena je kao prag za sve testove.
Za više informacija o dizajnu studije, pogledajte sažetak Izvještaja o istraživanju prirode (Nature Research Report) povezan s ovim člankom.
MS proteomski podaci su deponovani u ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) putem PRIDE Partner Repositoryja (https://www.ebi.ac.uk/pride/) sa identifikatorom skupa podataka PXD032157.
Skup podataka RNA-seq pohranjen je u Sveobuhvatnoj biblioteci ekspresije gena (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) pod serijskim brojem GSE198665.
Dodatni skupovi podataka generirani i/ili analizirani tokom trenutne studije mogu se dobiti od odgovarajućih autora na razuman zahtjev. Ovaj članak pruža izvorne podatke.
De Loof, A. Ekdisteroidi: Zanemareni spolni steroidi insekata? Muško: Black Box. Nauka o insektima. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroksiekdizon i razvoj jajnika kod Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).