Javascript je trenutno onemogućen u vašem pregledniku. Neke funkcije ove web stranice neće raditi kada je javascript onemogućen.
Registrujte se sa svojim specifičnim podacima i specifičnim lijekom koji vas zanima, a mi ćemo upariti informacije koje navedete sa člancima u našoj opsežnoj bazi podataka i odmah vam poslati PDF kopiju e-poštom.
Ban-Lan-Gen granule ublažavaju hronični recidivni kolitis izazvan dekstran natrijum sulfatom kod miševa moduliranjem crijevne mikrobiote i obnavljanjem proizvodnje crijevnih SCFA izvedenih iz GLP-1.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21 Pekinška univerzitetska bolnica u Shenzhenu, Odjel za farmaciju, Shenzhen, Narodna Republika Kina; 2 Zdravstveno-naučni centar Univerziteta u Shenzhenu, Farmaceutski fakultet, Shenzhen, Narodna Republika Kina; 3 Medicinski univerzitet u Guizhouu, Istraživački centar za inženjersku tehnologiju etničke medicine i razvoja i primjene tradicionalne kineske medicine, Ministarstvo obrazovanja, Ključna laboratorija za farmaciju pokrajine Guizhou, Medicinski univerzitet Guizhou, Guiyang, Narodna Republika Kina; 4 Odjel za gastroenterologiju, Bolnica Pekinškog univerziteta u Shenzhenu, Shenzhen, Narodna Republika Kina; 5 Farmaceutski fakultet, Medicinski univerzitet Guizhou, Državna ključna laboratorija za funkciju i primjenu ljekovitih biljaka, Guiyang; 6 Odsjek za laboratorijsku medicinu, Univerzitetska bolnica Peking Shenzhen, Shenzhen, Kina [email protected] Shen Xiangchun, Farmaceutski fakultet, Medicinski univerzitet Guizhou, Guizhou, Narodna Republika Kina, 550004, Email [email protected] Cilj: Terapija zasnovana na GLP-1 je nova opcija liječenja upalne bolesti crijeva. Granule Ban-Lan-Gen (BLG) su poznata antivirusna TCM formulacija koja pokazuje potencijalnu protuupalnu aktivnost u liječenju različitih upalnih stanja. Međutim, njegov protuupalni učinak na kolitis i mehanizam djelovanja još uvijek nisu jasni. METODE: Utvrditi hronični recidivirajući kolitis izazvan dekstran natrijum sulfatom (DSS) kod miševa. Indeksi aktivnosti bolesti, histološki markeri povrede i nivoi proinflamatornih citokina provedeni su kako bi se procijenio zaštitni učinak BLG-a. Učinci BLG-a na crijevnu mikrobiotu i crijeva karakterizirani su nivoima GLP-1 u serumu i ekspresijom Gcg, GPR41 i GRP43 u debelom crijevu, sastavom crijevne mikrobiote, nivoima SCFA u stolici i oslobađanjem GLP-1 iz Primarne ćelije mišjeg kolonskog epitela, proizvodnja GLP-1 izvedenih iz SCFA. Rezultati: Tretman BLG-om značajno je smanjio gubitak tjelesne težine, DAI, skraćivanje kolona, ​​oštećenje tkiva kolona i nivoe proinflamatornih citokina TNF-α, IL-1β i IL-6 u tkivu kolona. Pored toga, tretman BLG-om može značajno obnoviti ekspresiju kolonskog Gcg, GPR41 i GRP43 i nivoe GLP-1 u serumu kod miševa s kolitisom, povećanjem bakterija koje proizvode SCFA, kao što su Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001, i smanjenjem brojnosti bakterija kao što su Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas i Oscillibacter. Pored toga, tretman BLG-om može značajno povećati nivo SCFA u izmetu miševa s kolitisom. Istovremeno, in vitro eksperimenti su također pokazali da ekstrakt fekalija miševa tretiranih BLG-om može značajno stimulisati primarne male mišje kolonske epitelne ćelije koje luče GLP-1. Zaključci: Ovi nalazi ukazuju na to da BLG ima antikolitisni učinak. BLG ima potencijal da se razvije kao terapija, barem djelomično moduliranjem crijevne mikrobiote i obnavljanjem proizvodnje GLP-1 izvedenih iz crijevnih SCFA. Obećavajući lijekovi za kronični recidivni kolitis. Ključne riječi: kolitis, Ban-Lan-Gen granule, crijevna mikrobiota, kratkolančane masne kiseline, GLP-1
Ulcerozni kolitis (UK) je dugotrajna upalna bolest debelog crijeva i rektuma koju karakteriziraju ponavljajući proljevi, bolovi u trbuhu, gubitak težine i mukopurulentna krvava stolica.1 U posljednje vrijeme, prevalencija UK-a raste u zemljama s prethodno niskom incidencijom, uključujući Kinu, s rastućom popularnošću zapadnog načina života.2 Ovo povećanje predstavlja velike probleme za javno zdravlje i ima ozbiljne implikacije na radnu sposobnost pacijenata i kvalitet života. Važno je napomenuti da patogeneza UK-a ostaje uglavnom nejasna, ali je općeprihvaćeno da genetika, faktori okoline, crijevna mikrobiota i imunološki sistem doprinose razvoju UK-a.3 Čak ni sada ne postoji lijek za UK, a cilj liječenja je klinički kontrolirati kliničke simptome, izazvati i održavati remisiju, potaknuti zacjeljivanje sluznice i smanjiti recidiv. Klasični tretmani uključuju aminosalicilate, kortikosteroide, imunosupresore i biološke lijekove. Međutim, ovi lijekovi ne mogu postići željeni učinak zbog svojih različitih nuspojava.4 Nedavno su mnoge studije slučaja pokazale da je tradicionalna kineska medicina (TCM) pokazala veliki potencijal u ublažavanju UK-a. sa niskom toksičnošću, što ukazuje na to da je razvoj novih TCM terapija obećavajuća strategija liječenja ulceroznog kolitisa.5-7
Banlangen granule (BLG) su preparat tradicionalne kineske medicine napravljen od vodenog ekstrakta korijena Banlangen.8 Pored svoje antivirusne efikasnosti, BLG pokazuje potencijalnu antiinflamatornu aktivnost u liječenju različitih upalnih stanja.9,10 Pored toga, glukozinolati (R,S-goitrin, progoitrin, epiprorubin i glukozid su izolovani i identifikovani iz vodenih ekstrakata Radix isatidis) i nukleozidi (hipoksantin, adenozin, uridin i gvanozin) i indigo alkaloidi poput indiga i indirubina.11,12 Prethodne studije su dobro dokumentovale da jedinjenja adenozin, uridin i indirubin pokazuju snažne antikolitične efekte u različitim životinjskim modelima kolitisa.13-17 Međutim, nisu provedene studije zasnovane na dokazima za procjenu efikasnosti BLG kod kolitisa. U ovoj studiji istražili smo zaštitni efekat BLG na hronični recidivni kolitis izazvan dekstran natrijum sulfatom (DSS) kod miševa C57BL/6 i otkrili... da oralna primjena BLG značajno ublažava DSS-induciranu hroničnu recidivnu upalu debelog crijeva kod miševa, njeni regulatorni mehanizmi povezani su s modulacijom crijevne mikrobiote i obnavljanjem proizvodnje glukagonu sličnog peptida-1 (GLP-1) izvedenog iz crijeva.
BLG granule (bez šećera, odobrene od strane NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Peking, Kina; broj serije: 20110966) kupljene su u apotekama. DSS (molekularna težina: 36.000–50.000 daltona) kupljen je od MP Biologicals (Santa Ana, SAD). Sulfasalazin (SASP) (čistoća ≥ 98%), hematoksilin i eozin kupljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Mišji TNF-α, IL-1β i IL-6 luminex Elisa testovi kupljeni su od R&D systems (Minneapolis, MN, SAD). Sirćetna kiselina, propionska kiselina i buterna kiselina kupljene su od Aladdin Industries (Šangaj, Kina). 2-Etilbuterna kiselina kupljena je od Merck KGaA (Darmstadt, Njemačka).
Mužjaci miševa C57BL/6 starosti 6-8 sedmica (tjelesne težine 18-22 g) kupljeni su od Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Peking, Kina) i smješteni su u okruženju od 22 ± 2 °C sa 12-satnim ciklusom svjetlosti/tame. Miševi su hranjeni standardnom hranom za glodare sa slobodnim pristupom vodi za piće tokom jedne sedmice kako bi se aklimatizovali na novo okruženje. Miševi su zatim nasumično podijeljeni u četiri grupe: kontrolna grupa, DSS model grupa, grupa tretirana SASP-om (200 mg/kg, oralno) i grupa tretirana BLG-om (1 g/kg, oralno). Kao što je prikazano na slici 1A, prema našoj prethodnoj studiji, eksperimentalni hronični recidivni kolitis je izazvan kod miševa sa tri ciklusa 1,8% DSS-a tokom 5 dana, nakon čega je uslijedila destilovana voda tokom 7 dana, prema našoj prethodnoj studiji.18 Miševi u grupama tretiranim SASP-om i BLG-om tretirani su SASP-om i BLG-om, respektivno, svaki dan počevši od dana 0. Prema preliminarnim eksperimentima, doza BLG-a je bila postavljeno na 1 g/kg. U međuvremenu, doza SASP-a je postavljena na 200 mg/kg prema literaturi.4 Kontrolna i DSS modelna grupa su primale istu količinu vode tokom cijelog eksperimenta.
Slika 1 BLG ublažava DSS-inducirani hronični recidivirajući kolitis kod miševa. (A) Eksperimentalni dizajn hroničnog rekurentnog kolitisa i tretman, (B) promjena tjelesne težine, (C) rezultat indeksa aktivnosti bolesti (DAI), (D) dužina debelog crijeva, (E) reprezentativna slika debelog crijeva, (F) H&E bojenje debelog crijeva (uvećanje, ×100) i (G) histološki rezultat. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 6).##p < 0,01 ili ###p < 0,001 u odnosu na kontrolnu (Con) grupu; *p < 0,05 ili **p < 0,01 ili ***p < 0,001 u odnosu na DSS grupu.
Tjelesna težina, konzistencija stolice i rektalno krvarenje bilježeni su svakodnevno. Indeks aktivnosti bolesti (DAI) određen je kombinovanjem rezultata tjelesne težine, konzistencije stolice i rektalnog krvarenja kao što je prethodno opisano.19 Na kraju eksperimenta, svi miševi su eutanazirani, a krv, izmet i debelo crijevo su prikupljeni za daljnje eksperimente.
Tkivo debelog crijeva je fiksirano formalinom i ugrađeno u parafin. Napravljeni su rezovi od 5 mikrona i obojeni hematoksilin-eozinom (H&E), zatim zaslijepljeni i bodovani kao što je prethodno opisano.19
Ukupna RNK tkiva debelog crijeva ekstrahirana je Trizol reagensom (Invitrogen, Carlsbad, CA), nakon čega je uslijedila ekstrakcija cDNA reverznom transkriptazom (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japan). Kvantitativna PCR provedena je korištenjem PCR sistema u realnom vremenu sa SYBR Green Master (Roche, Basel, Švicarska). Transkripti ciljnih gena normalizirani su na β-aktin, a podaci su analizirani korištenjem 2-ΔΔCT metode. Sekvence genskih primera prikazane su u Tabeli 1.
Primarna izolacija i kultura ćelija mišjeg kolonskog epitela izvršene su kao što je prethodno opisano.20 Ukratko, kolon miševa starih 6-8 sedmica prvo je izrezan nakon žrtvovanja cervikalnom dislokacijom, zatim uzdužno otvoren, tretiran Hanksovim uravnoteženim rastvorom soli (HBSS, bez kalcijuma i magnezijuma) i izrezan na male komadiće debljine 0,5-1 mm. Nakon toga, tkiva su probavljena sa 0,4 mg/mL kolagenaze XI (Sigma, Poole, UK) u slobodnom DMEM mediju i centrifugirana na 300 xg tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Resuspendujte talog u DMEM mediju (dopunjenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 jedinica/mL penicilina i 100 µg/mL streptomicina) na 37 °C i propustite kroz najlonsku mrežicu (veličina pora ~250 µm). Alikvoti ćelija kolonskog epitela stavljeni su u posude sa staklenim dnom i inkubirani sa sirćetnom kiselinom, propionskom kiselinom, buternom kiselinom i ekstraktima mišjeg fekalija tokom 2 sata na 37°C, 5% CO2.
Tkivo debelog crijeva homogenizirano je s PBS-om, a nivoi citokina IL-6, TNF-α i IL-1β u tkivu debelog crijeva detektirani su korištenjem luminex ELISA test kitova (R&D systems, Minneapolis, MN, SAD). Slično tome, nivoi GLP-1 u serumu i mediju za kulturu primarnih mišjih epitelnih ćelija debelog crijeva određeni su ELISA kitom (Bioswamp, Wuhan, Kina) prema uputama proizvođača.
Ukupna DNK iz fecesa je ekstrahovana korištenjem kompleta za ekstrakciju DNK (Tiangen, Kina). Kvalitet i količina DNK su mjereni pri omjerima od 260 nm/280 nm i 260 nm/230 nm, respektivno. Nakon toga, koristeći svaku ekstrahovanu DNK kao predložak, specifični prajmeri 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) i 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) su korišteni za amplifikaciju V3-V4 regija 16S rRNA gena u različitim regijama. PCR produkti su pročišćeni korištenjem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Njemačka), kvantificirani PCR-om u realnom vremenu i sekvencirani korištenjem IlluminaMiseq PE300 platforme za sekvenciranje (Illumina Inc., CA, SAD). Za bioinformatičku analizu, obrada podataka je izvršena prema prethodno objavljenim protokolima.21,22 Ukratko, koristite Cutadapt (V1.9.1) za filtriranje sirovih ekspresnih datoteka. OTU-ovi su grupisani korištenjem UPARSE (verzija 7.0.1001) sa graničnom sličnošću od 97%, a UCHIME je korišten za uklanjanje himernih sekvenci. Analiza sastava zajednice i klasifikacija izvršene su korištenjem RDP klasifikatora (http://rdp.cme.msu.edu/) zasnovanog na SILVA bazi podataka gena ribosomske RNA.
Nivoi kratkolančanih masnih kiselina (sirćetne kiseline, propionske kiseline i buterne kiseline) mjereni su kako je prethodno opisano od strane Tao i saradnika, uz neke modifikacije.23 Ukratko, 100 mg fekalija je prvo suspendovano u 0,4 mL deionizovane vode, a zatim u 0,1 mL 50% sumporne kiseline i 0,5 mL 2-etilbuterne kiseline (interni standard), zatim homogenizovano i zagrejano na 4°C. Centrifugirati na 12.000 rpm tokom 15 minuta na 90°C. Supernatant je ekstrahovan sa 0,5 mL etera i ubrizgan u GC radi analize. Za analizu gasnom hromatografijom (GC), uzorci su analizirani pomoću GC-2010 Plus gasnog hromatografa (Shimadzu, Inc.) opremljenog detektorom jonizacije plamena (FID). Separacija je postignuta korištenjem ZKAT-624 kolone, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Kina). Podaci su prikupljeni korištenjem GC softvera za rastvore (Shimadzu, Inc.). Omjer podjele bio je 10:1, plin nosač bio je dušik, a brzina protoka 6 mL/min. Volumen ubrizgavanja bio je 1 μL. Temperatura injektora i detektora bila je 300°C. Temperatura pećnice održavana je na 140°C tokom 13,5 minuta, a zatim povećana na 250°C brzinom od 120°C/min; Temperatura je održavana 5 minuta.
Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna greška srednje vrijednosti (SEM). Značajnost podataka procijenjena je jednosmjernom ANOVA analizom, nakon čega je uslijedio Duncanov test višestrukih raspona. Za sve proračune korišten je GraphPad Prism 5.0 softver (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SAD), a p < 0,05 smatrano je statistički značajnim.
Dobro je poznato da je UC kronična recidivirajuća bolest kolitisa s jakim bolovima u trbuhu, proljevom i krvarenjem. Stoga je DSS-inducirani kronični recidivirajući kolitis kod miševa utvrđen kako bi se procijenila učinkovitost BLG-a protiv kolitisa (slika 1A). U usporedbi s kontrolnom skupinom, miševi u DSS modelnoj skupini imali su značajno smanjenu tjelesnu težinu i viši DAI, a ove promjene su značajno poništene nakon 24 dana BLG tretmana (slika 1B i C). Skraćivanje debelog crijeva važan je obilježje UC-a. Kao što je prikazano na slikama 1D i E, dužina debelog crijeva miševa koji su primili DSS bila je značajno skraćena, ali su ublaženi BLG tretmanom. Naknadno je provedena histopatološka analiza kako bi se procijenila upala debelog crijeva. H&E obojene slike i patološki rezultati pokazali su da je primjena DSS-a značajno poremetila arhitekturu debelog crijeva i rezultirala uništavanjem kripti, dok je BLG tretman značajno smanjio uništavanje kripti i patološke rezultate (slika 1F i G). Značajno je da je zaštitni učinak BLG-a u dozi od 1 g/Kg bio usporediv s onim SASP-a u dozi od od 200 mg/Kg. Zajedno, ovi nalazi ukazuju na to da je BLG efikasan u smanjenju težine hroničnog recidivnog kolitisa izazvanog DSS-om kod miševa.
TNF-α, IL-1β i IL-6 su važni inflamatorni markeri upale debelog crijeva. Kao što je prikazano na Slici 2A, DSS je izazvao značajno povećanje ekspresije gena TNF-α, IL-1β i IL-6 u debelom crijevu u poređenju sa kontrolnom grupom. Primjena BLG-a može značajno preokrenuti ove promjene posredovane DSS-om. Zatim smo koristili ELISA test za određivanje nivoa inflamatornih citokina TNF-α, IL-1β i IL-6 u tkivu debelog crijeva. Rezultati su također pokazali da su nivoi TNF-α, IL-1β i IL-6 u debelom crijevu značajno povećani kod miševa tretiranih DSS-om, dok je tretman BLG-om ublažio ova povećanja (Slika 2B).
Slika 2 BLG inhibira ekspresiju gena i proizvodnju proinflamatornih citokina TNF-α, IL-1β i IL-6 u debelom crijevu miševa tretiranih DSS-om. (A) Ekspresija gena TNF-α, IL-1β i IL-6 u debelom crijevu; (B) nivoi proteina debelog crijeva TNF-α, IL-1β i IL-6. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 ili ##p < 0,01 ili ###p < 0,001 u odnosu na kontrolnu (Con) grupu; *p < 0,05 ili **p < 0,01 u odnosu na DSS grupu.
Intestinalna disbioza je ključna u patogenezi ulceroznog kolitisa (UC).24 Kako bi se istražilo da li BLG modulira crijevnu mikrobiotu miševa tretiranih DSS-om, izvršeno je sekvenciranje 16S rRNA kako bi se analizirala bakterijska zajednica sadržaja crijeva. Vennov dijagram pokazuje da tri grupe dijele 385 OTU-a. Istovremeno, svaka grupa je imala jedinstvene OTU-e (slika 3A). Nadalje, Chao1 indeks i Shannon indeks prikazani na slici 3B i C pokazali su da je raznolikost zajednice crijevne mikrobiote smanjena kod miševa tretiranih BLG-om, jer je Shannon indeks značajno smanjen u grupi tretiranoj BLG-om. Analiza glavnih komponenti (PCA) i analiza glavnih koordinata (PCoA) korištene su za određivanje obrazaca klasteriranja među tri grupe i pokazale su da je struktura zajednice miševa tretiranih DSS-om jasno odvojena nakon tretmana BLG-om (slika 3D i E). Ovi podaci sugeriraju da je tretman BLG-om značajno utjecao na strukturu zajednice miševa s kolitisom izazvanim DSS-om.
Slika 3 BLG mijenja raznolikost crijevne mikrobiote kod miševa s kolitisom izazvanim DSS-om. (A) Vennov dijagram OTU-a, (B) Chao1 indeks, (C) Shannonov indeks bogatstva, (D) Grafik rezultata analize glavnih komponenti (PCA) OTU-a, (E) Slika rezultata analize glavnih koordinata (PCoA) OTU-a. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 6).**p < 0,01 u odnosu na DSS grupu.
Da bismo procijenili specifične promjene u fekalnoj mikrobioti, analizirali smo sastav crijevne mikrobiote na svim taksonomskim nivoima. Kao što je prikazano na Slici 4A, glavni koljeni u svim grupama bili su Firmicutes i Bacteroidetes, a zatim Verrucomicrobia. Relativna zastupljenost Firmicutes i omjera Firmicutes/Bacteroidetes značajno su povećani u fekalnim mikrobnim zajednicama miševa tretiranih DSS-om u poređenju sa kontrolnim miševima, a ove promjene su značajno poništene nakon tretmana BLG-om. Konkretno, tretman BLG-om značajno je povećao relativnu zastupljenost Verrucobacterium u izmetu miševa sa kolitisom izazvanim DSS-om. Na nivou domaćinstva, fekalne mikrobne zajednice su zauzimale Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae i Prevotellaceae (Slika 4B). U poređenju sa DSS grupom, smanjenje broja BLG-a povećalo je zastupljenost Akkermansiaceae, ali je smanjilo zastupljenost Lachnospiraceae i Ruminococcaceae. Značajno je da je na nivou roda... Fekalnu mikrobiotu su zauzele Lachnospira_NK4A136_grupa, Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001 (Sl. 4C). Ovo otkriće je također pokazalo da je BLG tretman efikasno preokrenuo neravnotežu mikrobiote kao odgovor na DSS izazov, što je karakterizirano smanjenjem Eubacterium_xylanophilum_grupe, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas i Oscillibacter, te povećanjem Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001.
Slika 4 BLG mijenja brojnost crijevne mikrobiote kod miševa s kolitisom izazvanim DSS-om. (A) Brojnost crijevne mikrobiote na nivou koljena; (B) Brojnost crijevne mikrobiote na nivou porodice; (C) Brojnost crijevne mikrobiote na nivou roda. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 6).#p < 0,05 ili ###p < 0,001 u odnosu na kontrolnu (Con) grupu; *p < 0,05 ili **p < 0,01 ili ***p < 0,001 u odnosu na DSS grupu.
S obzirom na to da su kratkolančane masne kiseline (SCFA) glavni metaboliti Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001, dok su acetat, propionat i butirat najzastupljenije SCFA u crijevnom lumenu, 25-27 još uvijek smo u našoj studiji. Kao što je prikazano na Slici 5, koncentracije acetata, propionata i butirata u fecesu bile su značajno smanjene u grupi tretiranoj DSS-om, dok je tretman BLG-om mogao uveliko suzbiti ovo smanjenje.
Slika 5. BLG povećava nivoe SCFA u izmetu miševa sa DSS-induciranim kolitisom. (A) Sadržaj sirćetne kiseline u izmetu; (B) Sadržaj propionske kiseline u izmetu; (C) Sadržaj buterne kiseline u izmetu. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 6). #p < 0,05 ili ##p < 0,01 u odnosu na kontrolnu (Con) grupu; *p < 0,05 ili **p < 0,01 u odnosu na DSS grupu.
Dalje smo izračunali Pearsonov koeficijent korelacije između diferencijalnih SCFA na nivou roda i fekalne mikrobiote. Kao što je prikazano na Slici 6, Akkermansia je bila pozitivno korelirana sa proizvodnjom propionske kiseline (Pearson = 0,4866) i buterne kiseline (Pearson = 0,6192). Nasuprot tome, i Enteromonas i Oscillobacter su bili negativno povezani sa proizvodnjom acetata, sa Pearsonovim koeficijentima od 0,4709 i 0,5104, respektivno. Slično tome, Ruminococcaceae_UCG-014 je bio negativno koreliran sa proizvodnjom propionske kiseline (Pearson = 0,4508) i buterne kiseline (Pearson = 0,5842), respektivno.
Slika 6 Pearsonova korelacijska analiza između diferencijalnih SCFA i kolonskih mikroba. (A) Enteromonas sa sirćetnom kiselinom; (B) Bacil potresa mozga sa sirćetnom kiselinom; (C) Akkermansia vs propionska kiselina; (D) Ruminococcus_UCG-014 sa propionskom kiselinom; (E) Akkermansia sa buternom kiselinom; (F) Ruminococcus _UCG-014 sa buternom kiselinom.
Glukagonu sličan peptid-1 (GLP-1) je posttranslacijski produkt proglukagona (Gcg) specifičan za tip ćelije sa protivupalnim svojstvima.28 Kao što je prikazano na Slici 7, DSS je izazvao značajno smanjenje ekspresije Gcg mRNA. Tretman debelog crijeva i BLG-a mogao je značajno preokrenuti smanjenje Gcg izazvano DSS-om u poređenju sa kontrolnom grupom (Slika 7A). Istovremeno, nivo GLP-1 u serumu je značajno smanjen u grupi tretiranoj DSS-om, a tretman BLG-om je mogao u velikoj mjeri spriječiti ovo smanjenje (Slika 7B). Budući da masne kiseline kratkog lanca mogu stimulisati sekreciju GLP-1 putem aktivacije receptora 43 spregnutog sa G-proteinom (GRP43) i receptora 41 spregnutog sa G-proteinom (GRP41), također smo ispitali GPR41 i GRP43 u debelom crijevu miševa sa kolitisom i otkrili da je ekspresija GRP43 i GPR41 mRNA u debelom crijevu značajno smanjena nakon izazivanja DSS-om, a tretman BLG-om je mogao efikasno spasiti ova smanjenja (Slika 7C i D).
Slika 7 BLG povećava nivoe GLP-1 u serumu i ekspresiju mRNA Gcg, GPR41 i GRP43 u debelom crijevu kod miševa tretiranih DSS-om. (A) Ekspresija mRNA Gcg u tkivu debelog crijeva; (B) Nivo GLP-1 u serumu; (C) Ekspresija mRNA GPR41 u tkivu debelog crijeva; (D) Ekspresija mRNA GPR43 u tkivu debelog crijeva. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 ili ##p < 0,01 u odnosu na kontrolnu (Con) grupu; *p < 0,05 u odnosu na DSS grupu.
Budući da tretman BLG-om može povećati nivoe GLP-1 u serumu, ekspresiju mRNA Gcg u debelom crijevu i nivoe SCFA u stolici kod miševa tretiranih DSS-om, dalje smo ispitali acetat, propionat i butirat, kao i kod kontrolnih (F-Con), DSS kolitisa (F-Con) -DSS) i BLG-tretiranih miševa sa kolitisom (F-BLG) na oslobađanje GLP-1 iz primarnih mišjih epitelnih ćelija debelog crijeva. Kao što je prikazano na Slici 8A, primarne mišje epitelne ćelije debelog crijeva tretirane sa 2 mM sirćetne kiseline, propionske kiseline i buterne kiseline, respektivno, značajno su stimulisale oslobađanje GLP-1, što je u skladu sa prethodnim studijama.29,30 Slično tome, svi F-Con, F-DSS i F-BLG (ekvivalentno 0,25 g fecesa) uveliko su stimulisali oslobađanje GLP-1 iz primarnih mišjih epitelnih ćelija debelog crijeva. Značajno je da je količina GLP-1 oslobođena od primarnih mišjih epitelnih ćelija debelog crijeva tretiranih F-DSS-om bila mnogo niža od one kod primarnih miševa tretiranih F-Con i F-BLG-om. epitelne ćelije debelog crijeva (Slika 8B). Ovi podaci ukazuju na to da je tretman BLG-om značajno obnovio proizvodnju GLP-1 izvedenih iz crijevnih SCFA.
Slika 8 SCFA izvedene iz BLG-a stimulišu oslobađanje GLP-1 iz primarnih mišjih epitelnih ćelija debelog crijeva. (A) Sirćetna kiselina, propionska kiselina i buterna kiselina stimulisale su oslobađanje GLP-1 iz primarnih mišjih epitelnih ćelija debelog crijeva; (B) fekalni ekstrakti F-Con, F-DSS i F-BLG stimulisali su primarne mišje epitelne ćelije debelog crijeva. Količina oslobođenog GLP-1. Alikvoti kolonskih epitelnih ćelija stavljeni su u Petrijeve zdjelice sa staklenim dnom i tretirani sa 2 mM sirćetne kiseline, propionske kiseline, buterne kiseline i fekalnim ekstraktima F-Con, F-DSS i F-BLG (ekvivalentno 0,25 g fecesa). 2 sata na 37°C, 5% CO2. Količina GLP-1 oslobođenog iz primarnih mišjih epitelnih ćelija debelog crijeva detektovana je ELISA testom. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 3). #p < 0,05 ili ##p < 0,01 u odnosu na slijepu probu ili F-Con; *p < 0,05 u odnosu na F-DSS.
Skraćenice: Ace, sirćetna kiselina; Pro, propionska kiselina; međutim, buterna kiselina; F-Con, fekalni ekstrakt kontrolnih miševa; F-DSS, fekalni ekstrakt miševa s kolitisom; F-BLG, iz debelog crijeva tretiranog BLG-om. Fekalni ekstrakti inflamatornih miševa.
Ulcerozni kolitis, koji je Svjetska zdravstvena organizacija navela kao refraktornu bolest, postaje globalna opasnost; Međutim, efikasne metode za predviđanje, prevenciju i liječenje bolesti su još uvijek ograničene. Stoga postoji hitna potreba za istraživanjem i razvojem novih sigurnih i efikasnih terapijskih strategija za ulcerozni kolitis (UC). Preparati tradicionalne kineske medicine su obećavajuća opcija jer se za mnoge preparate tradicionalne kineske medicine pokazalo da su efikasni u liječenju UC kod kineske populacije tokom vijekova, a svi su to biološki organski i prirodni materijali koji su uglavnom bezopasni za ljude i životinje.31,32 Cilj ove studije bio je pronaći siguran i efikasan preparat tradicionalne kineske medicine za liječenje UC i istražiti njegov mehanizam djelovanja. BLG je dobro poznata kineska biljna formula koja se koristi za liječenje gripe.8,33 Rad u našoj i drugim laboratorijama pokazao je da indigo, prerađeni proizvod tradicionalne kineske medicine od iste sirovine kao i BLG, pokazuje značajnu efikasnost u liječenju UC kod ljudi i životinja.4,34 Međutim, antikolitisni efekti BLG-a i njegov mehanizam djelovanja nisu jasni. U trenutnoj studiji, naši rezultati pokazuju da BLG efikasno ublažava upalu debelog crijeva izazvanu DSS-om, koja je povezana s modulacijom crijevne mikrobiote. i obnavljanje proizvodnje GLP-1 iz crijeva.
Dobro je poznato da se UC karakterizira relapsirajućim periodima s tipičnim kliničkim karakteristikama, kao što su gubitak težine, dijareja, rektalno krvarenje i opsežno oštećenje sluznice debelog crijeva.35 Stoga je kronični relapsirajući kolitis primijenjen primjenom tri ciklusa 1,8% DSS-a tokom pet dana, nakon čega je slijedilo sedam dana pijenja vode. Kao što je prikazano na slici 1B, fluktuirajući gubitak težine i DAI rezultati ukazivali su na uspješnu indukciju kroničnog relapsirajućeg kolitisa. Miševi u grupi tretiranoj BLG-om pokazali su oporavak od 8. dana, što se značajno razlikovalo od 24. dana. Iste promjene uočene su i u DAI rezultatu, što ukazuje na poboljšanje kliničkog poboljšanja kolitisa. U smislu oštećenja debelog crijeva i upalnog statusa, dužina debelog crijeva, oštećenje tkiva debelog crijeva te ekspresija gena i proizvodnja proinflamatornih citokina TNF-α, IL-1β i IL-6 u tkivu debelog crijeva također su se znatno poboljšali nakon tretmana BLG-om. Zajedno, ovi rezultati jasno pokazuju da je BLG učinkovit u liječenju kroničnog relapsirajućeg kolitisa kod miševa.
Kako BLG ispoljava svoje farmakološke efekte? Brojne prethodne studije su pokazale da crijevna mikrobiota igra ključnu ulogu u patogenezi ulceroznog kolitisa (UK), a terapije zasnovane na mikrobiomu i usmjerene na mikrobiom pojavile su se kao vrlo atraktivna strategija za liječenje UK. U ovoj studiji smo pokazali da je tretman BLG-om rezultirao značajnim promjenama u sastavu crijevne mikrobiote, što sugerira da je zaštitni učinak BLG-a protiv kolitisa izazvanog DSS-om povezan s modulacijom crijevne mikrobiote. Ovo zapažanje je u skladu s idejom da je reprogramiranje homeostaze crijevne mikrobiote važan pristup razumijevanju efikasnosti TCM preparata.36,37 Posebno je važno napomenuti da je Akkermansia gram-negativna i strogo anaerobna bakterija koja živi u sloju sluzi crijeva, koja razgrađuje mucine, proizvodi propionsku kiselinu, stimulira diferencijaciju vrčastih ćelija i održava funkciju integriteta barijere sluznice.26 Višestruki klinički i životinjski podaci sugeriraju da je Akkermansia u velikoj mjeri povezana sa zdravom sluznicom,38 a oralna primjena Akkermansia spp. može značajno poboljšati upalu sluznice.39 Naši trenutni podaci ukazuju na to da se relativna zastupljenost Akkermansia značajno povećava nakon tretmana BLG-om. Osim toga, Prevotellaceae_UCG-001 je bakterija koja proizvodi SCFA.27 Višestruke studije su pokazale da je Prevotellaceae_UCG-001 pronađen u niskoj relativnoj zastupljenosti u izmetu životinja s kolitisom.40,41 Naši trenutni podaci također pokazuju da tretman BLG-om može značajno povećati relativnu zastupljenost Prevotellaceae_UCG-001 u debelom crijevu miševa tretiranih DSS-om. Nasuprot tome, Oscillibacter je mezofilna, strogo anaerobna bakterija.42 izvijestio je da je relativna zastupljenost Oscillibactera značajno povećana kod UC miševa i da je značajno pozitivno korelirala s nivoima IL-6 i IL-1β i patološkim rezultatima.43,44 Važno je napomenuti da je tretman BLG-om značajno smanjio relativnu zastupljenost Oscillibactera u izmetu miševa tretiranih DSS-om. Važno je napomenuti da su ove BLG-izmijenjene bakterije bile bakterije koje najviše proizvode SCFA. Brojne prethodne studije su pokazale potencijalne korisne učinke SCFA. na upalu debelog crijeva i zaštitu integriteta crijevnog epitela.45,46 Naši trenutni podaci također su uočili da su koncentracije SCFA acetata, propionata i butirata u izmetu tretiranom DSS-om bile znatno povećane kod miševa tretiranih BLG-om. Uzeti zajedno, ovi nalazi jasno pokazuju da BLG tretman može efikasno pojačati bakterije koje proizvode SCFA izazvane DSS-om kod miševa s kroničnim recidivnim kolitisom.
GLP-1 je inkretin koji se uglavnom proizvodi u ileumu i debelom crijevu i igra važnu ulogu u odgađanju pražnjenja želuca i snižavanju postprandijalne glukoze u krvi.47 Dokazi ukazuju na to da dipeptidil peptidaza (DPP)-4, agonist GLP-1 receptora i GLP-1 nanomedicina mogu efikasno ublažiti upalu crijeva kod miševa.48-51 Kao što je zabilježeno u prethodnim studijama, visoke koncentracije SCFA bile su povezane s nivoima GLP-1 u plazmi kod ljudi i miševa. 52 Naši trenutni podaci pokazuju da su nakon tretmana BLG-om, nivoi GLP-1 u serumu i ekspresija Gcg mRNA značajno povećani. Slično tome, sekrecija GLP-1 značajno je povećana u kulturama debelog crijeva nakon stimulacije fekalnim ekstraktima miševa s kolitisom tretiranih BLG-om u poređenju sa stimulacijom fekalnim ekstraktima miševa s kolitisom tretiranih DSS-om. Kako SCFA utiču na oslobađanje GLP-1? Gwen Tolhurst i sar. izvijestili su da SCFA mogu stimulirati sekreciju GLP-1 putem GRP43 i GPR41.29 Naši trenutni podaci također pokazuju da tretman BLG-om značajno povećava ekspresiju mRNA GRP43 i GPR41 u debelom crijevu miševa tretiranih DSS-om. Ovi podaci sugeriraju da tretman BLG-om može obnoviti proizvodnju GLP-1 koju potiču SCFA aktiviranjem GRP43 i GPR41.
BLG je lijek koji se dugoročno izdaje bez recepta (OTC) u Kini. Maksimalna tolerisana doza BLG-a kod miševa iz Kunminga je 80 g/kg, a nije uočena akutna toksičnost.53 Trenutno je preporučena doza BLG-a (bez šećera) kod ljudi 9-15 g/dan (3 puta dnevno). Naša studija je pokazala da BLG u dozi od 1 g/kg ublažava hronični recidivni kolitis izazvan DSS-om kod miševa. Ova doza je blizu dozi BLG-a koja se klinički koristi. Naša studija je također otkrila da je njegov mehanizam djelovanja posredovan, barem djelimično, promjenama u crijevnoj mikrobioti, posebno bakterijama koje proizvode SCFA, kao što su Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001, kako bi se obnovila proizvodnja GLP-1 izvedenog iz crijeva. Ovi nalazi sugeriraju da BLG zaslužuje daljnje razmatranje kao potencijalno terapijsko sredstvo za kliničko liječenje kolitisa. Međutim, tačan mehanizam kojim modulira crijevnu mikrobiotu tek treba da se potvrdi miševima s nedostatkom mikrobiote i transplantacijom fekalnih bakterija.
Ace, sirćetna kiselina; but, buterna kiselina; BLG, pandan; DSS, dekstran natrijum sulfat; DAI, indeks aktivnosti bolesti; DPP, dipeptidil peptidaza; FID, detektor jonizacije plamena; F-Con, kontrola; Ekstrakti fekalija miševa; F-DSS, ekstrakti fekalija miševa sa DSS kolitisom; F-BLG, ekstrakti fekalija miševa tretiranih BLG-om; GLP-1, peptid sličan glukagonu-1; Gcg, glukagon; gasna hromatografija, gasna hromatografija; GRP43, receptor 43 vezan za G protein; GRP41, receptor 41 vezan za G protein; H&E, hematoksilin-eozin; HBSS, Hanksov uravnoteženi rastvor soli; OTC, OTC; PCA, analiza glavnih komponenti; PCoA, analiza glavnih koordinata; Pro, propionska kiselina; SASP, sulfasalazin; SCFA, masne kiseline kratkog lanca; kineska medicina, tradicionalna kineska medicina; UC, ulcerozni kolitis.
Sve eksperimentalne protokole odobrio je Komitet za etiku životinja Univerziteta u Pekingu, Medicinskog centra za nauku i tehnologiju Univerziteta u Shenzhenu-Hong Kongu (Shenzhen, Kina) u skladu sa Institucionalnim smjernicama i Pravilnikom o životinjama (etički broj A2020157).
Svi autori su dali značajan doprinos koncepciji i dizajnu, prikupljanju podataka ili analizi i interpretaciji podataka; učestvovali su u izradi članka ili kritičkoj reviziji važnog intelektualnog sadržaja; pristali su da predaju rukopis trenutnom časopisu; konačno odobrili verziju za objavljivanje; bili su odgovorni za sve aspekte rada.
Ovaj rad su podržali Nacionalna fondacija za prirodne nauke Kine (81560676 i 81660479), prvoklasni projekat Univerziteta u Shenzhenu (86000000210), Fond Komiteta za inovacije u nauci i tehnologiji Shenzhena (JCYJ20210324093810026) i Fond za istraživanje medicinskih nauka i tehnologije provincije Guangdong (A2020157 i A2020272), Farmaceutski fond Medicinskog univerziteta Guizhou provincije Guizhou, finansiran od strane Key Laboratory (YWZJ2020-01) i Bolnica Univerziteta u Pekingu u Shenzhenu (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, et al. Terapijski potencijal triptolida kao protuupalnog sredstva kod eksperimentalnog kolitisa izazvanog dekstran natrijum sulfatom kod miševa. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Globalni teret IBD-a: od 2015. do 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727.doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue i dr. Alkaloidi biljnog porijekla: obećavajući modifikatori bolesti kod inflamatornih bolesti crijeva. Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B, et al. Indigo Naturalis inhibira oksidativni stres debelog crijeva i Th1/Th17 odgovore kod kolitisa izazvanog DSS-om kod miševa. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Učinkovitost i sigurnost kineske biljne medicine Sophora flavescens (Sophora flavescens) u liječenju ulceroznog kolitisa: klinički dokazi i potencijalni mehanizmi. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Prirodni proizvodi: eksperimentalno efikasni lijekovi za liječenje upalnih bolesti crijeva. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Razmišljanja o adjuvantnom liječenju ulceroznog kolitisa tradicionalnom kineskom medicinom. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT, et al. Efikasnost i sigurnost Banlangen granula u liječenju sezonske gripe: protokol studije za randomizirano kontrolirano ispitivanje.trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x