Sortiranje proteina u sekretornom putu je ključno za održavanje kompartmentalizacije ćelija i homeostaze. Pored sortiranja posredovanog ljuskom, uloga lipida u sortiranju kinezina u procesu sekretornog transporta je dugogodišnje osnovno pitanje na koje još nije odgovoreno. Ovdje izvodimo 3D simultano višebojno snimanje visoke rezolucije u realnom vremenu kako bismo in vivo dokazali da su novo sintetizirani proteini imobilizirani glikozilfosfatidilinozitolom s vrlo dugim ceramidnim lipidnim dijelovima grupirani i klasifikovani u specijalizirana izlazna mjesta endoplazmatske mreže, koja se razlikuju od onog koje koriste transmembranski proteini. Osim toga, pokazujemo da je dužina lanca ceramida u membrani endoplazmatskog retikuluma ključna za ovu selektivnost sortiranja. Naša studija pruža prve direktne in vivo dokaze za klasifikaciju proteinskih tereta na osnovu dužine lipidnog lanca u selektivna izvozna mjesta u sekretornom putu.
U eukariotskim ćelijama, proteini sintetizirani u endoplazmatskom retikulumu (ER) se zatim sortiraju tokom transporta kroz sekretorni put radi isporuke do odgovarajućeg ćelijskog odredišta (1). Pored sortiranja posredovanog omotačem, dugo se nagađalo da određeni lipidi mogu poslužiti i kao selektivne izlazne tačke grupiranjem u specifične membranske domene koje specifični proteini (2-5). Međutim, još uvijek nedostaju direktni in vivo dokazi koji bi dokazali ovaj mogući mehanizam zasnovan na lipidima. Kako bismo riješili ovaj osnovni problem, proučavali smo na kvascu kako se proteini usidreni glikozilfosfatidilinozitolom (GPI) (GPI-AP) diferencijalno izvoze iz ER-a. GPI-AP su različiti proteini ćelijske površine povezani lipidima (6, 7). GPI-AP je sekretovani protein vezan za vanjske listove plazma membrane putem glikolipidnog dijela (GPI sidro). Oni prihvataju GPI sidra kao konzervativne posttranslacijske modifikacije u lumenu ER-a (8). Nakon vezivanja, GPI-AP prolazi kroz Golgijev aparat (5, 9) od ER-a do plazma membrane. Prisustvo GPI sidra uzrokuje da se GPI-AP transportuje odvojeno od transmembranski izlučenih proteina (uključujući i druge proteine ​​plazma membrane) duž sekretornog puta (5, 9, 10). U ćelijama kvasca, GPI-AP-ovi se odvajaju od drugih izlučenih proteina u endoplazmatskom retikulumu, a zatim pakuju u jedinstvene vezikule obavijene kompleksom proteina omotača II (COPII) (6, 7). Determinante ovog procesa klasifikacije u procesu izvoza ER-a nisu jasne, ali se nagađa da ovaj mehanizam može zahtijevati lipide, posebno strukturno remodeliranje lipidnog dijela GPI sidra (5, 8). U kvascu, remodeliranje GPI lipida počinje odmah nakon vezivanja GPI-a, a u mnogim slučajevima uzrokuje vezivanje ceramida za zasićenu masnu kiselinu dugog lanca sa 26 ugljika (C26:0) (11, 12). C26 ceramid je glavni ceramid koji do sada proizvode ćelije kvasca. Sintetizira se u ER-u, a većina se izvozi u Golgijev aparat putem COPII vezikula (13). Izvoz GPI-AP-a iz ER-a specifično zahtijeva kontinuiranu sintezu ceramida (14, 15), a zauzvrat, konverzija ceramida u inozitol-fosfat ceramid (IPC) u Golgijevom aparatu zavisi od sinteze GPI sidra (16). Biofizičke studije sa vještačkim membranama pokazale su da se ceramidi sa vrlo dugim acilnim lancem mogu spojiti i formirati uređene domene sa jedinstvenim fizičkim svojstvima (17, 18). Ovi podaci vode do hipoteze da C26 ceramid i GPI-AP sa C26 ceramidom koriste svoja fizička svojstva za spajanje u uređene regije ili regije u relativno neurednom lipidnom okruženju ER membrane. Uglavnom se sastoji od kratkih i nezasićenih glicerolipida (C16:1 i C18:1) (19, 20). Ove regije će biti selektivno fokusirane na specifična izlazna mjesta ER-a (ERES), gdje se ceramid i GPI-AP na bazi ceramida mogu kotransportovati do Golgijevog aparata u istoj namjenskoj COPII vezikuli (5).
U ovoj studiji, direktno smo testirali ovaj mehanizam zasnovan na lipidima korištenjem superrezolucijske konfokalne mikroskopije u realnom vremenu (SCLIM), što je najsavremenija tehnika mikroskopije koja može istovremeno posmatrati fluorescentno obilježene proteine. Trobojne i trodimenzionalne (3D) slike imaju izuzetno visoku rezoluciju i brzinu u živim ćelijama (21, 22).
Prvo smo primijenili SCLIM tehnologiju kako bismo dalje definirali kako je normalni GPI-AP sa C26 ceramidnom grupom odvojen od transmembranski izlučenih proteina nakon napuštanja ER-a kod S. cerevisiae. Kako bismo provjerili klasifikaciju ER-a, koristili smo genetički sistem koji može direktno vizualizirati novo sintetizirani teret koji ulazi u ERES in vivo (7, 23). Kao teret, odabrali smo GPI-AP Gas1 baziran na C26 ceramidu, označen zelenim fluorescentnim proteinom (GFP), i transmembranski izlučeni protein Mid2, označen blisko infracrvenim fluorescentnim proteinom (iRFP), koji oba ciljaju plazma membranu (24–26). Kod temperaturno osjetljivog mutanta sec31-1, ova dva tereta se eksprimiraju pod galaktozom-inducibilnim promotorom i konstitutivnim ERES markerom. Na ekstremnoj temperaturi (37°C), budući da mutacija sec31-1 utiče na funkciju COPII komponente omotača Sec31 da inhibira klijanje COPII i izvoz ER-a, novo sintetizirani teret se akumulira na ER-u (23). Nakon hlađenja na nisku temperaturu (24°C), mutirane ćelije sec31-1 su se oporavile iz sekretornog područja, a akumulirani novi sintetički teret je počeo da se izvozi iz ER-a. CLIM vizualizacija je pokazala da se većina novo sintetiziranog Gas1-GFP i Mid2-iRFP i dalje akumulirala u ER-u mutiranih ćelija sec31-1 nakon inkubacije na 37°C, a zatim oslobođena na 24°C tokom 5 minuta (Slika 1). Budući da je Mid2-iRFP distribuiran po cijeloj ER membrani, a Gas1-GFP je koncentrisan i sakupljen u diskontinuiranom području ER membrane, njihova distribucija je potpuno drugačija (Slika 1, A do C i Film S1). Osim toga, kao što je prikazano na Slici 1D, Gas1-GFP klaster nema Mid2-iRFP. Ovi rezultati ukazuju na to da su GPI-AP i transmembranski proteini rano odvojeni u različite regije ER membrane. Klaster Gas1-GFP nalazi se pored specifičnog ERES-a označenog mCherryjevim COPII proteinom omotača Sec13 (Slika 1, E i F, te film S1) (23).
Ćelije sec31-1 eksprimiraju galaktozom izazvane sekrecije, ceramid dugog acilnog lanca (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, zelena) i transmembranski protein Mid2-iRFP (TMP, plava), a ovo konstruktivno ERES označavanje Sec13-mCherry (ERES, magenta) inkubirano je na 37°C tokom 30 minuta, premješteno na 24°C i snimljeno SCLIM-om 5 minuta kasnije. (A do C) prikazuje reprezentativnu spojenu ili pojedinačnu 2D sliku ravni (A), 2D projekcijsku sliku 10 z-sekcija (B) ili 3D sliku hemisfere ćelije tereta i ERES markera (C). Mjerna traka 1μm (A i B). Jedinica mjerila je 0,551μm (C). Gas1-GFP je detektovan u diskretnim ER regijama ili klasterima, dok je Mid2-iRFP detektovan i distribuiran po cijeloj ER membrani (C). (D) Grafikon prikazuje relativni intenzitet fluorescencije Gas1-GFP i Mid2-iRFP u Gas1-GFP klasteru duž bijele linije strelice (lijevo). AU, proizvoljna jedinica. (E i F) predstavljaju 3D sliku koja kombinuje oznake robe i ERES. Gas1-GFP klasteri su detektovani u blizini specifičnog ERES-a. Jedinica skale je 0,551 μm. (F) Bijela puna strelica označava Gas1-GFP klaster povezan sa ERES-om. Srednji i desni panel prikazuju spojenu uvećanu 3D sliku i rotirani prikaz odabranog Gas1-GFP klastera.
Bliski prostorni odnos između Gas1-GFP klastera i specifičnog ERES-a ukazuje na to da Gas1-GFP može ući u selektivni ERES, što se razlikuje od selektivnosti koju Mid2-iRFP koristi za napuštanje ER-a. Da bismo se pozabavili ovom mogućnošću, kvantificirali smo ERES omjer za samo jednu ili dvije robe (Slika 2, A do C). Otkrili smo da većina ERES-a (70%) sadrži samo jednu vrstu tereta. Donja slika Slike 2C prikazuje dva tipična primjera ERES-a samo sa Gas1-GFP (Slika 1) ili samo sa Mid2-iRFP (Slika 2). Nasuprot tome, približno 20% ERES-a sadrži dva tereta koja se preklapaju u istom području. Utvrđeno je da neki ERES (10%) sadrže dvije vrste tereta, ali su izolirani u jasno različitim područjima. Stoga, ova statistička analiza pokazuje da nakon izvoza ER-a, GPI-AP Gas1-GFP i transmembranski teret Mid2-iRFP su podijeljeni u različite ERES-ove (Slika 2D). Ova efikasnost sortiranja je vrlo konzistentna s prethodnom biokemijskom analizom (6) i morfološkim određivanjem (7). Također možemo promatrati ponašanje karantinskog tereta koji ulazi u ERES (Slika 2E i Film S2). Slika 2E pokazuje da samo mali dio Gas1-GFP (panel 3) ili Mid2-iRFP (panel 4) ulazi u ERES s jedne strane i ograničen je na zasebno područje. Panel 5 Slike 2E pokazuje da se Gas1-GFP i Mid2-iRFP ponekad nalaze u istom ERES-u, ali ulaze s različitih strana i koncentrirani su u odvojenim regijama koje mogu predstavljati različite COPII vezikule. Također smo potvrdili da je uočena separacija i klasifikacija GPI-AP Gas1 na bazi C26 ceramida kao selektivnog ERES-a specifična jer drugi transmembranski sekretni teret, GFP-označeni protein plazma membrane Axl2 (27), pokazuje slično ponašanje kao Mid2-iRFP. (Slika S1 i Film S3). Novosintetizirani Axl2-GFP se distribuira kroz ER membranu poput Mid2-iRFP (Slika S1, A i B) i kolokaliziran je s Mid2-iRFP u većini ERES-a (Slika S1, B do D). Paneli 1 i 2 na Slici 1. S1C prikazuju dva tipična primjera ERES-a gdje se dva transmembranska tereta preklapaju. U ovim slučajevima, oba tereta ulaze u ERES zajedno (Slika S1E, Panel 3 i Film S3).
Ćelije sec31-1 koje eksprimiraju galaktozom inducibilne sekrecije, Gas1-GFP (GPI-AP, zelena) i Mid2-iRFP (TMP, plava) i konstitutivno ERES označavanje Sec13-mCherry (ERES, magenta) su postavljene na 37°C. Nakon inkubacije od 30 minuta na °C, premještene su na 24 °C da bi se oslobodio blok sekrecije i snimljene su SCLIM-om nakon 20 minuta. (A do C) Reprezentativne 2D projekcijske slike (A; skala, 1μm) ili 3D slike hemisfere ćelija (B i C; jedinica skale, 0,456μm) tereta i 10 z-sekcija označenih sa ERES. Donji panel u (B) i panel u (C) prikazuju obrađene slike kako bi se prikazala samo roba prisutna u ERES-u (magenta) [Gas1-GFP (siva) i Mid2-iRFP (svijetloplava)]. (C) Otvorena strelica: ERES nosi samo jedan komad tereta (1 do 4). Siva strelica: ERES sadrži segregirani teret (5). Bijela puna strelica: ERES sadrži kolokirani teret. Ispod: Odabrani pojedinačni ERES sadrži samo Gas1-GFP (1) ili Mid2-iRFP (2). Mjerna traka, 100 nm. (D) Kvantifikacija fotomikrografije opisane u (C). Prosječan postotak ERES-a koji sadrži samo jedan teret (Gas1-GFP ili Mid2-iRFP), segregirani teret i preklapajući teret. U tri nezavisna eksperimenta, n=432 u 54 ćelije. Traka greške = SD. Dvostrani neparni t-test. *** P = 0,0002. (E) 3D slika odabranog ERES-a karantinskog tereta označenog sa (C). Gas1-GFP (zeleno) (3) ili Mid2-iRFP (plavo) (4) ulazi u ERES (magenta) s jedne strane i ograničen je na malo područje unutar ERES-a. Ponekad obje vrste tereta ulaze u isti ERES (5) s iste strane i ograničene su na izolirano područje unutar ERES-a. Mjerna traka, 100 nm.
Zatim smo testirali hipotezu da dugi acilni lanac ceramida (C26) prisutan u ER membrani pokreće specifično grupiranje i sortiranje Gas1 u selektivne ERES. U tu svrhu koristili smo modificirani soj kvasca GhLag1, u kojem su dvije endogene ceramidne sintaze Lag1 i Lac1 zamijenjene s GhLag1 (homologom Lag1 pamuka), što je rezultiralo sojem kvasca s ceramidnom membranom ćelijske membrane kraćom od divljeg tipa (Slika 3A) (28). Analiza masenom spektrometrijom (MS) pokazala je da je u sojevima divljeg tipa 95% ukupnog ceramida ceramid vrlo dugog (C26) lanca, dok je u GhLag1 85% ceramida vrlo dugo (C18 i C16), samo 2% ceramida ceramid vrlo dugog (C26) lanca. Iako su C18 i C16 ceramidi do sada glavni ceramidi detektovani u membrani GhLag1, MS analiza je također potvrdila da GPI sidro Gas1-GFP eksprimirano u soju GhLag1 sadrži C26 ceramid, koji je uporediv s lipidima divljeg tipa. Kvalitet je isti (Slika 3A) (26). Stoga, to znači da je enzim za remodeliranje ceramida Cwh43 visoko selektivan za C26 ceramid, kao što je prikazano na Slici 26, on preferencijalno uključuje GPI sidro iz male količine C26 ceramida u soju GhLag1. S2 (29). Ipak, ćelijska membrana GhLag1 u osnovi sadrži samo C18-C16 ceramid, dok Gas1-GFP i dalje ima C26 ceramid. Ova činjenica čini ovaj soj idealnim alatom za specifično rješavanje problema dužine acilnog lanca membranskog ceramida u ER-u. Hipotetska uloga klase i sortiranja. Zatim smo prvo proučavali sposobnost C26 Gas1-GFP da se akumulira u klasterima u GhLag1 sa temperaturno osjetljivim mutantnim alelom sec31-1 putem konvencionalne fluorescentne mikroskopije, gdje samo dugi (C18-C16) lanac postoji u ceramidu ER membrane (Slika 3). Primijetili smo da je u sec31-1 većina Gas1-GFP koncentrirana u klasterima, dok Gas1-GFP u sec31-1 GhLag1 sa dugom (C18-C16) ceramidnom ER membranom uglavnom nije bio klasteriran i distribuiran u cijeloj ER membrani. Preciznije, budući da je klasteriranje na bazi ceramida C26 usko povezano sa specifičnim ERES-om (Slika 1), zatim smo istražili da li ovaj proces može uključivati ​​i funkciju mehanizma proteina za izvoz ER-a. GPI-AP koristi poseban COPII sistem za izvoz ER-a, koji je aktivno reguliran Ted1-ovim strukturnim remodeliranjem glikanskog dijela GPI sidra (30, 31). Rekombinantni GPI-glikan zatim prepoznaje transmembranski kompleks receptora tereta p24, koji zauzvrat selektivno regrutuje Lst1, što je specifična izoforma glavne COPII podjedinice za vezivanje tereta Sec24, formirajući COPII bogat GPI-AP-om. Vezikule su neophodne (31-33). Stoga smo konstruisali dvostruki mutant koji je kombinovao deleciju ovih pojedinačnih proteina (komponenta p24 kompleksa Emp24, enzim za remodeliranje GPI-glikana Ted1 i specifična COPII podjedinica Lst1) sa mutantnim sojem sec31-1 i proučavali ih. Da li je moguće formirati Gas1-klaster GFP (Slika 3). Primijetili smo da je u sec31-1emp24Δ i sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP uglavnom neklasterovan i distribuiran po cijeloj ER membrani, kao što je prethodno viđeno u sec31-1 GhLag1, dok je u sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP sličan sec31-1. Ovi rezultati ukazuju na to da pored prisustva C26 ceramida u ER membrani, grupisanje Gas1-GFP također zahtijeva vezivanje za p24 kompleks i ne zahtijeva specifično regrutovanje Lst1. Zatim smo istražili mogućnost da dužina lanca ceramida u ER membrani može regulisati vezivanje Gas1-GFP za p24. Međutim, otkrili smo da prisustvo C18-C16 ceramida u membrani ne utiče na GPI-glikane rekonstruisane p24 kompleksom (Slike S3 i S4, A i B) ili na vezivanje za GPI-AP i sposobnost izvoza GPI-AP. Regrutuje COPII podtip Lst1 (Slika S4C). Stoga, grupisanje zavisno od C26 ceramida ne zahtijeva interakcije proteina s različitim mehanizmima izvoza proteina ER, ali podržava alternativni mehanizam sortiranja vođen dužinom lipida. Zatim smo analizirali da li je dužina acilnog lanca ceramida u ER membrani važna za efikasnu klasifikaciju Gas1-GFP kao selektivnog ERES-a. Budući da Gas1 u soju GhLag1 s kratkolančanim ceramidom napušta ER i ulazi u plazmatsku membranu (Slika S5), vjerujemo da ako je sortiranje vođeno dužinom acilnog lanca ceramida, Gas1 u soju GhLag1 može biti preusmjeren i ukršten. ERES proizvodi s istom membranom.
(A) Ćelijska membrana GhLag1 uglavnom sadrži kraće C18-C16 ceramide, dok GPI sidro Gas1-GFP i dalje ima isti C26 IPC kao i ćelije divljeg tipa. Iznad: Analiza dužine acilnog lanca ceramida u ćelijskoj membrani sojeva divljeg tipa (Wt) i GhLag1p pomoću masene spektrometrije (MS). Podaci predstavljaju procenat ukupnog ceramida. Prosjek tri nezavisna eksperimenta. Traka greške = SD. Dvostrani nespareni t-test. **** P <0,0001. Donji panel: MS analiza dužine acilnog lanca IPC-a prisutnog u GPI sidru Gas1-GFP (GPI-IPC) eksprimiranom u sojevima divljeg tipa i GhLag1p. Podaci predstavljaju procenat ukupnog IPC signala. Prosjek pet nezavisnih eksperimenata. Traka greške = SD. Dvostrani nespareni t-test. ns, nije važno. P = 0,9134. (B) Fluorescentne mikrografije ćelija sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ i sec31-1lst1Δ koje eksprimiraju Gas1-GFP induciran galaktozom inkubirane su na 37°C tokom 30 minuta i proslijeđene na rutinsku fluorescentnu mikroskopiju nakon 24°C. Bijela strelica: ER Gas1-GFP klaster. Otvorena strelica: Neklasterirani Gas1-GFP je raspoređen po cijeloj ER membrani, pokazujući karakteristično bojenje nuklearnog prstena za ER. Mjerna traka, 5μm. (C) Kvantifikacija fotomikrografije opisane u (B). Prosječan procenat ćelija sa tačkastom Gas1-GFP strukturom. U tri nezavisna eksperimenta, n≥300 ćelija. Traka greške = SD. Dvostrani neparni t-test. **** P <0,0001.
Da bismo direktno riješili ovaj problem, izvršili smo SCLIM vizualizaciju Gas1-GFP i Mid2-iRFP u GhLag1 sa temperaturno osjetljivim mutantnim alelom sec31-1 (Slika 4 i Film S4). Nakon što je ER zadržan na 37°C, a potom oslobođen na 24°C, većina novo sintetiziranog Gas1-GFP nije bila grupirana i distribuirana po cijeloj ER membrani, kao što je uočeno konvencionalnim mikroskopima (Slika 4, A i B). Osim toga, veliki postotak ERES-a (67%) uključuje dvije vrste tereta koje se nalaze u njemu (Slika 4D). Paneli 1 i 2 na Slici 4C prikazuju dva tipična primjera ERES-a sa preklapajućim Gas1-GFP i Mid2-GFP. Osim toga, oba tereta su regrutovana u isti ERES (Slika 4E, panel 3 i film S4). Stoga, naši rezultati pokazuju da je dužina ceramidnog acilnog lanca u ER membrani važna odrednica agregacije i klasifikacije ER proteina.
Sec31-1 GhLag1 ćelije koje eksprimiraju galaktozom indukovane sekrete, Gas1-GFP (GPI-AP, zelena) i Mid2-iRFP (TMP, plava) i konstitutivni ERES-obilježeni Sec13-mCherry (ERES, magenta) Inkubirajte na 37°C. Nastavite 30 minuta, spustite na 24°C da biste oslobodili sekrete i snimite SCLIM-om nakon 20 minuta. (A do C) Reprezentativne 2D projekcijske slike (A; skala, 1μm) ili 3D slike hemisfere ćelija (B i C; jedinica skale, 0,45μm) 10 z-sekcija označenih teretom i ERES-om. Donji panel u (B) i panel u (C) prikazuju obrađene slike kako bi se prikazali samo materijali prisutni u ERES-u (magenta) [Gas1-GFP (siva) i Mid2-iRFP (svijetloplava)]. (C) Bijela strelica: ERES, materijali se preklapaju. Otvorena strelica: ERES sadrži samo jednu stavku. Donja ploča: Odabrani ERES ima preklapajuće robe (1 i 2) označene u (C). Mjerna traka, 100 nm. (D) Kvantifikacija fotomikrografije opisane u (C). U jedinicama sec31-1 i sec31-1 GhLag1, uključen je samo jedan teret (Gas1-GFP ili Mid2-iRFP), te prosječan postotak ERES-a za izolirani teret i preklapajući teret. U tri nezavisna eksperimenta, n = 432 u 54 ćelije (sec31-1) i n = 430 u 47 ćelija (sec31-1 GhLag1). Traka greške = SD. Dvostrani neparni t-test. *** P = 0,0002 (sec31-1) i ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D slika odabranog ERES-a s preklapajućim teretom (3) označenim u (C). Gas1-GFP (zeleno) i Mid2-iRFP (plavo) prilaze ERES-u (magenta) sa iste strane i ostaju u istom ograničenom području ERES-a. Mjerna traka, 100 nm.
Ova studija pruža direktne in vivo dokaze da se proteinski tereti na bazi lipida klasifikuju u selektivna mjesta za izvoz u sekretornom putu i otkriva važnost dužine acilnog lanca za selektivnost klasifikacije. Koristeći moćnu i najsavremeniju mikroskopsku tehniku ​​pod nazivom SCLIM, demonstrirali smo novo sintetizirani Gas1-GFP (glavni GPI-AP plazma membrane sa vrlo dugim acilnim lancem (C26) ceramidnim lipidnim dijelom) u kvascu. Regije grupisane u diskretnim ER-ovima povezane su sa specifičnim ERES-om, dok su transmembranski izlučeni proteini distribuirani po cijeloj ER membrani (Slika 1). Osim toga, ove dvije vrste dobara selektivno ulaze u različite ERES-ove (Slika 2). Dužina acilnog lanca ćelijskog ceramida u membrani se smanjuje sa C26 na C18-C16, Gas1-GFP klaster se prekinut u diskretnu ER regiju, a Gas1-GFP se preusmjerava da napusti ER sa transmembranskim proteinom kroz isti ERES (Slika 3 i Slika 3). 4).
Iako GPI-AP koristi specijalizirani proteinski mehanizam za izlazak iz ER-a, otkrili smo da se separacija zavisna od C26 ceramida ne oslanja na diferencijalne interakcije proteina koje mogu dovesti do specijalizacije ERES-a (Slike S4 i S5). Umjesto toga, naši nalazi podržavaju alternativni mehanizam klasifikacije vođen grupiranjem proteina na bazi lipida i naknadnim isključivanjem drugih tereta. Naša zapažanja pokazuju da Gas1-GFP regiji ili klasteru povezanom sa specifičnim ERES-om nedostaje transmembranski izlučeni protein Mid2-iRFP, što ukazuje na to da će C26 ceramid-zavisni GPI-AP klaster olakšati njihov ulazak u relevantni ERES, a istovremeno isključiti transmembranski ulazak sekreta u ovaj određeni ERES (Slike 1 i 2). Nasuprot tome, prisustvo C18-C16 ceramida u ER membrani ne uzrokuje formiranje regija ili klastera od strane GPI-AP-a, tako da oni ne isključuju niti zamjenjuju transmembranski izlučene proteine ​​u istom ERES-u (Slike 3 i 4). Stoga pretpostavljamo da C26 ceramid potiče separaciju i klasifikaciju olakšavajući grupisanje proteina povezanih sa specifičnim ERES-om.
Kako postići ovo grupisanje C26 ceramida zavisno od nje u specifično područje ER-a? Tendencija membranskog ceramida da se lateralno odvoji može uzrokovati da GPI-AP i C26 ceramid formiraju male i trenutno uređene lipide u nepravilnijem lipidnom okruženju ER membrane koji sadrži kraće i nezasićene glicerolipide. Kvalitetni klasteri (17, 18). Ovi mali privremeni klasteri mogu se dalje spajati u veće, stabilnije klastere nakon vezivanja za p24 kompleks (34). U skladu s tim, pokazali smo da C26 Gas1-GFP treba da interaguje sa p24 kompleksom kako bi formirao veće vidljive klastere (Slika 3). P24 kompleks je heterozigotni oligomer sastavljen od četiri različita transmembranska proteina p24 u kvascu (35), koji omogućava multivalentno vezivanje, što može dovesti do unakrsnog povezivanja malih GPI-AP klastera, čime se generiše veći stabilni klaster (34). Interakcija između proteinskih ektodomena GPI-AP-ova također može doprinijeti njihovoj agregaciji, kao što je prikazano tokom njihovog Golgijevog transporta u polarizovanim epitelnim ćelijama sisara (36). Međutim, kada je C18-C16 ceramid prisutan u ER membrani, kada se p24 kompleks veže za Gas1-GFP, neće se formirati veliki odvojeni klasteri. Osnovni mehanizam može zavisiti od specifičnih fizičkih i hemijskih svojstava ceramida dugog acilnog lanca. Biofizičke studije vještačkih membrana pokazuju da iako i ceramidi dugog (C24) i kratkog (C18-C16) acilnog lanca mogu uzrokovati razdvajanje faza, samo ceramidi dugog acilnog lanca (C24) mogu promovisati visoku zakrivljenost i savijanje filma kako bi preoblikovali film. Kroz međusobnu referencu (17, 37, 38). Pokazano je da transmembranska spirala TMED2, ljudskog homologa Emp24, selektivno interaguje sa sfingomijelinom na bazi C18 ceramida u citoplazmatskim lobulima (39). Korištenjem simulacija molekularne dinamike (MD), otkrili smo da se i C18 i C26 ceramidi akumuliraju oko citoplazmatskih lobula transmembranske spirale Emp24 i da imaju slične preferencije (Slika S6). Vrijedi napomenuti da ovo ukazuje na to da transmembranska spirala Emp24 može dovesti do asimetrične distribucije lipida u membrani. Ovo je nedavni rezultat zasnovan na ćelijama sisara. Slične MD simulacije također pokazuju prisustvo eterskih lipida (40). Stoga pretpostavljamo da je C26 ceramid u dva lobula ER26 lokalno obogaćen. Kada se GPI-AP u luminalnim lobulama direktno veže za multivalentni p24 i akumulacija C26 ceramida oko p24 u citoplazmatskim lobulama može potaknuti prateću agregaciju proteina i zakrivljenost membrane koja se generira kroz prste (41), uzrokujući odvajanje GPI-AP u diskretne regije uz ERES, što također pogoduje jako zakrivljenim regijama ER membrane (42). Prethodni izvještaji podržali su predloženi mehanizam (43, 44). Multivalentno vezivanje oligolektina, patogena ili antitijela za glikosfingolipide na bazi ceramida (GSL) na plazmatskoj membrani pokreće veliku agregaciju GSL-a, pojačava fazno razdvajanje i uzrokuje deformaciju i internalizaciju membrane (44). Iwabuchi itd. (43) Utvrđeno je da u prisustvu dugih (C24), ali ne i kratkih (C16) acilnih lanaca, multivalentni ligand vezan za GSL laktozilceramid indukuje formiranje velikih klastera i invaginaciju membrane, a citoplazmatska Lyn-posredovana signalna transdukcija na listićima je isprepletena acilnim lancima u spregnutim neutrofilima.
U polarizovanim epitelnim ćelijama sisara, koncentracija anti-Golgi mreže (TGN) do nivoa apikalne plazma membrane kontroliše separaciju i sortiranje GPI-AP (10, 45). Ova agregacija je vođena GPI-AP oligomerizacijom (36), ali može zavisiti i od dužine ceramidnog lanca koju nalazimo u kvascu. Iako sisarski GPI-AP ima sidro na bazi eter lipida, a njegova hemijska struktura se veoma razlikuje od ceramida vrlo dugog acilnog lanca, nedavna studija je otkrila da oba lipida imaju evolucijski slična fizička i hemijska svojstva i funkciju (40). Stoga, dio eter lipida u ćelijama sisara može biti sličan C26 ceramidu u kvascu, a njegova uloga je da se poveže sa ceramidom dugog lanca u membrani kako bi se promovisala agregacija i sortiranje GPI-AP. Iako ovu mogućnost još treba direktno testirati, prethodni nalazi podržavaju da se transport ceramida dugog acilnog lanca do Golgijevog tijela ne vrši citoplazmatskim transfer proteinima, već zavisi od sinteze GPI sidara kao kod kvasca. Stoga se čini da evolucijski konzervativni mehanizam može selektivno ko-transportovati ceramid vrlo dugog acilnog lanca i GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) u istoj transportnoj vezikuli.
U sistemima polariziranih epitelnih ćelija kvasca i sisara, agregacija i odvajanje GPI-AP-a od drugih proteina plazma membrane se dešavaju prije nego što dosegnu površinu ćelije. Paladino i saradnici (48) su otkrili da na TGN-u polariziranih epitelnih ćelija sisara, klasterovanje GPI-AP-a nije neophodno samo za selektivnu klasifikaciju GPI-AP-a na apikalnu plazma membranu, već i reguliše organizaciju klasterovanja GPI-AP-a i njegovu biološku aktivnost. Površina ćelije. Kod kvasca, ova studija je pokazala da C26 ceramid-zavisni GPI-AP klaster na ER-u može regulisati organizaciju klastera i funkcionalnu aktivnost GPI-AP-a na plazma membrani (24, 49). U skladu sa ovim modelom, GhLag1 ćelije su alergične na GPI inhibitore ili lijekove koji utiču na integritet ćelijskog zida (28), a potreba za funkcionalnim Gas1-GFP klasterima (49) vrha ceramida projektovanog u parenju ćelija kvasca ukazuje na G. Moguće fiziološke posljedice hLag1 ćelija. Greška GPI-AP-a. Međutim, daljnje testiranje da li je funkcionalna organizacija ćelijske površine programirana iz ER-a metodom sortiranja zasnovanom na dužini lipida bit će predmet naših budućih istraživanja.
Sojevi Saccharomyces cerevisiae korišteni u ovom radu navedeni su u Tabeli S1. Sojevi MMY1583 i MMY1635 SCLIM-a za snimanje živih ćelija konstruirani su u pozadini W303. Ovi sojevi koji eksprimiraju Sec13-mCherry s fluorescentnom proteinskom oznakom konstruirani su korištenjem metode zasnovane na lančanoj reakciji polimeraze (PCR) s plazmidom pFA6a kao predloškom (23). Soj koji eksprimira Mid2-iRFP obilježen fluorescentnim proteinom pod kontrolom GAL1 promotora konstruiran je na sljedeći način. PCR amplifikacija iRFP-KanMx sekvence iz pKTiRFP-KAN vektora (poklon E. O'Shea, Addgene plazmid broj 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identifikator istraživačkog resursa (RRID): Addgene_64687) i umetnuta u C-terminus endogenog Mid2. Nakon što je sekvenca genoma Mid2-iRFP amplificirana i klonirana u GAL1 promotor, integrirana je u Not I-Sac I mjesto integracije plazmida pRS306. Rezultirajući plazmid pRGS7 je lineariziran s Pst I kako bi se integrirao u lokus URA3.
Fuzijski gen Gas1-GFP se eksprimira pod kontrolom GAL1 promotora u centromernom (CEN) plazmidu, koji je konstruiran na sljedeći način. Sekvenca Gas1-GFP je amplificirana PCR-om iz plazmida pRS416-GAS1-GFP (24) (poklon od L. Popolo) i klonirana u Xma I–Xho I mjesto CEN plazmida pBEVY-GL LEU2 (poklon od C). Miller; Addgene plazmid broj 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Rezultirajući plazmid je nazvan pRGS6. Fuzijski gen Axl2-GFP se također eksprimira pod kontrolom GAL1 promotora vektora pBEVY-GL LEU2, a njegova konstrukcija je sljedeća. Sekvenca Axl2-GFP je amplificirana iz plazmida pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) pomoću PCR-a i klonirana u Bam HI-Pst I mjesto vektora pBEVY-GL LEU2. Rezultirajući plazmid je nazvan pRGS12. Sekvenca oligonukleotida korištenih u ovoj studiji navedena je u Tabeli S2.
Soj je obogaćen sa 0,2% adenina i 2% glukoze [YP-dekstroza (YPD)], 2% rafinozom [YP-rafinoza] bogatim proteinskim p (YP) medijem ekstrakta kvasca (1% ekstrakta kvasca i 2% proteinskog ept. (YPR)] ili 2% galaktozom [YP-galaktoza (YPG)] kao izvorom ugljika, ili u sintetičkom minimalnom mediju (0,15% dušične baze kvasca i 0,5% amonijum sulfata) radi dopune odgovarajućih aminokiselina i baza potrebnih za ishranu, te koji sadrži 2% glukoze (sintetički minimalni medij glukoze) ili 2% galaktoze (sintetički minimalni medij galaktoze) kao izvor ugljika.
Za snimanje u realnom vremenu, temperaturno osjetljive sec31-1 mutirane ćelije koje eksprimiraju konstrukt pod GAL1 promotorom uzgajane su u YPR medijumu na 24°C preko noći do sredine log faze. Nakon indukcije u YPG na 24°C tokom 1 sata, ćelije su inkubirane u SG na 37°C tokom 30 minuta, a zatim prebačene na 24°C radi oslobađanja iz bloka sekrecije. Konkanavalin A je korišten za fiksiranje ćelija na staklenoj pločici i snimanje SCLIM-om. SCLIM je kombinacija inverznog fluorescentnog mikroskopa Olympus IX-71 i uljnog sočiva UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), brzog i visokog odnosa signal-šum konfokalnog skenera s rotirajućim diskom (Yokogawa Electric), prilagođenog spektrometra i prilagođenog hlađenja. Pojačivač slike sistema (Hamamatsu Photonics) može obezbijediti sistem uveličavajućih sočiva s konačnim uvećanjem od ×266.7 i kameru sa uređajem sa spregnutim nabojem koja množi elektrone (Hamamatsu Photonics) (21). Akvizicija slike se vrši pomoću prilagođenog softvera (Yokogawa Electric). Za 3D slike, koristili smo prilagođeni piezoelektrični aktuator za vertikalno vibriranje objektiva i sakupili optičke dijelove udaljene 100 nm u snop. Z-složena slika se pretvara u 3D voksel podatke, a teorijska funkcija širenja tačaka koja se koristi za konfokalni mikroskop s rotirajućim diskom koristi se za dekonvolucijsku obradu pomoću Volocity softvera (PerkinElmer). Korištenjem Volocity softvera za automatsko određivanje praga za analizu kolokacije, izmjeren je ERES, uključujući teret. Analiza linijskog skeniranja izvršena je korištenjem MetaMorph softvera (Molecular Devices).
Koristite GraphPad Prism softver za određivanje statističke značajnosti. Za dvostrani Studentov t-test i obični jednosmjerni test analize varijanse (ANOVA), razlike između grupa se smatraju značajnim utjecajem na P <0,05 (*).
Za fluorescentnu mikroskopiju Gas1-GFP, ćelije u log fazi su uzgajane preko noći u YPD i sakupljene centrifugiranjem, isprane dva puta fosfatno puferovanim fiziološkim rastvorom i inkubirane na ledu najmanje 15 minuta, a zatim su obrađene pod mikroskopom kao što je prethodno opisano (24). Za akviziciju je korišten Leica DMi8 mikroskop (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) opremljen objektivom, L5 (GFP) filterom, Hamamatsu kamerom i softverom Application Suite X (LAS X).
Uzorci su denaturirani SDS puferom za uzorke na 65°C tokom 10 minuta, a zatim odvojeni SDS-poliakrilamidnom gel elektroforezom (PAGE). Za imunobloting analizu, 10 μl uzorka je naneseno po traci. Primarno antitijelo: Koristiti zečje poliklonsko anti-Gas1 u razrjeđenju 1:3000, zečje poliklonsko anti-Emp24 u razrjeđenju 1:500 i zečje poliklonsko anti-GFP (poklon od H. Riezmana) u razrjeđenju 1:3000. Mišje monoklonsko anti-Pgk1 antitijelo korišteno je u razrjeđenju 1:5000 (poklon od J. de la Cruza). Sekundarno antitijelo: Kozji anti-zečji imunoglobulin G (IgG) konjugiran s hren peroksidazom (HRP) korišten u razrjeđenju 1:3000 (Pierce). Kozji anti-mišji IgG konjugiran s HRP korišten je u razrjeđenju 1:3000 (Pierce). Zona imunološkog odgovora posmatrana je metodom hemiluminiscencije pomoću SuperSignal West Pico reagensa (Thermo Fisher Scientific).
Kao što je opisano u (31), eksperiment prirodne imunoprecipitacije proveden je na obogaćenoj ER frakciji. Ukratko, ćelije kvasca isprati TNE puferom [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida i smjesa inhibitora proteaze) na 600 nm (OD600) pri optičkoj gustoći od 100 dva puta. Razbijen je staklenim kuglicama, a zatim su ostaci ćelija i staklene kuglice uklonjeni centrifugiranjem. Supernatant je zatim centrifugiran na 17.000 g tokom 15 minuta na 4°C. Talog je resuspendiran u TNE i dodan je digitalis saponin do konačne koncentracije od 1%. Suspenzija je inkubirana 1 sat uz rotaciju na 4°C, a zatim su nerastvorljive komponente uklonjene centrifugiranjem na 13.000 g na 4°C tokom 60 minuta. Za imunoprecipitaciju Gas1-GFP, prvo se uzorak prethodno inkubira s praznim agaroznim kuglicama (ChromoTek) na 4°C tokom 1 sata, a zatim se inkubira s GFP-Trap_A (ChromoTek) na 4°C tokom 3 sata. Imunoprecipitirane kuglice su isprane pet puta s TNE koji sadrži 0,2% digoksigenina, eluirane SDS puferom za uzorke, odvojene na SDS-PAGE i analizirane imunoblotingom.
Kao što je opisano u (31), određivanje umrežavanja je provedeno na obogaćenoj ER frakciji. Ukratko, obogaćena ER frakcija je inkubirana sa 0,5 mM ditiobis(sukcinimidil propionatom) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, SAD; 20°C, 20 min). Reakcija umrežavanja je prekinuta dodavanjem glicina (konačna koncentracija 50 mM, 5 minuta, 20°C).
Kao što je prethodno opisano (50), izvršena je MS analiza ceramida u sojevima divljeg tipa i GhLag1. Ukratko, ćelije su uzgajane do eksponencijalne faze (3 do 4 OD600 jedinice/ml) u YPD na 30°C, a sakupljeno je 25×107 ćelija. Njihov metabolizam je ugašen trihlorosirćetnom kiselinom. Koristi se rastvarač za ekstrakciju [etanol, voda, eter, piridin i 4,2 N amonijum hidroksid (15:15:5:1:0,018 v/v)] i 1,2 nmol internog standarda C17 ceramida (860517, Avanti polarni lipid) kvaliteta). Koristi se monometilaminski reagens [metanol, voda, n-butanol i rastvor metilamina (4:3:1:5 v/v)] za izvođenje blage alkalne hidrolize ekstrakta, a zatim se koristi n-butanol zasićen vodom za odsoljavanje. Konačno, ekstrakt je resuspendiran u rastvaraču pozitivnog moda [kloroform/metanol/voda (2:7:1) + 5 mM amonijum acetat] i ubrizgan u maseni spektrometar. Višestruko reakcijsko praćenje (MRM) je provedeno za identifikaciju i kvantifikaciju molekula sfingolipida. TSQ Vantage tercijarni kvadrupolni maseni spektrometar (Thermo Fisher Scientific) je opremljen robotskim nanoflow izvorom iona Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) za analizu lipida. Energija sudara je optimizirana za svaku kategoriju ceramida. MS podaci su dobiveni u pozitivnom modu. Za svaku biološku repliku, lipidni signal je medijan tri nezavisna mjerenja.
Kao što je opisano u (31), ćelije (800×107) koje eksprimiraju Gas1-GFP podvrgnute su prirodnoj imunoprecipitaciji. Prečišćeni Gas1-GFP je odvojen SDS-PAGE i prebačen na poliviniliden fluoridnu (PVDF) membranu. Protein je vizualiziran bojenjem PVDF-a amidnom crnom bojom. Gas1-GFP traka je izrezana iz PVDF-a i isprana 5 puta metanolom i jednom vodom tečne hromatografije-MS (LC-MS) kvalitete. Inkubacijom membranske trake sa 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), pufera i 500 μl svježe rastvorene 1 M smjese natrijum nitrita na 37°C tokom 3 sata, lipidna frakcija se oslobađa iz Gas1-GFP i lizira se oslobađanje inozin fosfat ceramida između glukozamina i inozitola (51). Nakon toga, membranska traka je isprana četiri puta vodom LC-MS kvalitete, osušena na sobnoj temperaturi i pohranjena u atmosferi dušika na -80°C do analize. Kao kontrola, za svaki eksperiment korišten je slijepi uzorak PVDF membrane. Lipid ekstrahiran iz Gas1-GFP zatim je analiziran MS-om kao što je opisano (50). Ukratko, PVDF trake koje sadrže GPI-lipid resuspendirane su u 75 μl negativnog rastvarača za kalup [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonijum acetat] i podvrgnute analizi sfingolipidnih vrsta elektrosprejnom ionizacijom (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). U ovom slučaju, MS podaci su dobiveni u modu negativnih iona.
Kao što je ranije spomenuto, lipidni dio GPI sidra je odvojen od [3H]-inozitolom obilježenog GPI-AP-a (16). Lipidi su odvojeni tankoslojnom hromatografijom korištenjem sistema rastvarača (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) i vizualizirani korištenjem FLA-7000 (Fujifilm).
Ćelije koje eksprimiraju Gas1-GFP (600×107) isprane su dva puta s TNE puferom i razbijene staklenim kuglicama, a zatim centrifugirane kako bi se uklonili ostaci ćelija i staklene kuglice. Supernatant je zatim centrifugiran na 17.000 g tokom 1 sata na 4°C. Talog je ispran u TNE i inkubiran sa 1 U PI-PLC (Invitrogen) u TNE koji sadrži 0,2% digitalis saponina tokom 1 sata na 37°C. Nakon tretmana enzimima, membrana je uklonjena centrifugiranjem na 17.000 g na 4°C tokom 1 sata. Za imunoprecipitaciju Gas1-GFP, supernatant je inkubiran sa GFP-Trap_A (ChromoTek) na 4°C preko noći. Prečišćeni Gas1-GFP odvojen SDS-PAGE obojen je Coomassie briljantno plavom bojom. Gas1-GFP traka za bojenje je odsječena od sive boje koja okružuje akvadukt, a zatim, nakon alkilacije jodoacetamidom i redukcije ditiotreitolom, izvršena je digestija u gelu tripsinom. Ekstraktovati i osušiti triptinske peptide i peptide sa GPI-glikanima. Osušeni peptid je rastvoren u 20 μl vode. Ubrizgati dio (8 μl) u LC. Za odvajanje peptida pod specifičnim gradijentnim uslovima korištena je oktadecilsilanska (ODS) kolona (Develosil 300ODS-HG-5; unutrašnji prečnik 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan). Mobilna faza je rastvarač A (0,08% mravlja kiselina) i rastvarač B (0,15% mravlja kiselina u 80% acetonitrilu). Za eluiranje kolone rastvaračem A u roku od 55 minuta pri brzini protoka od 50 μl min-1 tokom 5 minuta korišten je Accela HPLC sistem (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts), a zatim je koncentracija rastvarača B povećana na 40%. (Thermo Fisher Scientific, Sjedinjene Američke Države). Eluat je kontinuirano uvođen u ESI izvor iona, a triptični peptidi i peptidi sa GPI-glikanima analizirani su pomoću LTQ Orbitrap XL (hibridni linearni jonski trap-orbitrap maseni spektrometar; Thermo Fisher Scientific). U MS postavci, napon kapilarnog izvora postavljen je na 4,5 kV, a temperatura transferne kapilare održavana je na 300°C. Napon kapilare i napon sočiva cijevi postavljeni su na 15 V i 50 V, respektivno. MS podaci su dobijeni u modu pozitivnih iona (rezolucija od 60.000; tačnost mase od 10 dijelova na milion) u rasponu mase od 300/m/z, odnos mase/naboja (m/z) 3000. MS/MS podaci su dobijeni putem ionske zamke u LTQ Orbitrap XL [prve 3 cifre od kojih podaci zavise, disocijacija izazvana sudarima (CID)].
MD simulacije su provedene korištenjem GROMACS (52) softvera i MARTINI 2 polja sile (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) je zatim korišten za konstrukciju dvosloja koji sadrži dioleoilfosfatidilholin (DOPC) i Cer C18 ili DOPC i Cer C26. Topologija i koordinate Cer C26 su izvedene iz DXCE uklanjanjem dodatnih kuglica iz sfingozinskog repa. Koristite proces opisan u nastavku za balansiranje dvostrukog sloja i njegovo pokretanje, a zatim koristite posljednje koordinate sistema za izgradnju sistema koji sadrži Emp24. Transmembranski domen kvasca Emp24 (ostaci 173 do 193) je konstruiran kao α-heliks korištenjem alata za molekularnu strukturu vizualnog MD (VMD) (58). Zatim, nakon uklanjanja preklapajućih lipida, protein je grubo granuliran i umetnut u dvosloj korištenjem CHARMM GUI-ja. Konačni sistem sadrži 1202 DOPC i 302 Cer C26 ili 1197 DOPC i 295 Cer C18 i Emp24. Sistem se jonizuje do koncentracije od 0,150 M. Napravljene su četiri nezavisne replike za dva dvoslojna sastava.
Lipidni dvosloj se balansira korištenjem CHARMM GUI procesa, koji uključuje minimiziranje, a zatim balansiranje 405.000 koraka, gdje se ograničenja položaja postepeno smanjuju i eliminiraju, a vremenski korak se povećava sa 0,005 ps na 0,02 ps. Nakon uravnoteženja, proizvodi 6 µs sa vremenskim korakom od 0,02 ps. Nakon umetanja Emp24, koristite isti CHARMM GUI proces za minimiziranje i balansiranje sistema, a zatim ga pokrenite 8 s u produkciji.
Za sve sisteme, tokom procesa balansiranja, pritisak se kontroliše Berendsenovim barostatom (59), a tokom procesa proizvodnje, pritisak se kontroliše Parrinello-Rahmanovim barostatom (60). U svim slučajevima, prosječni pritisak je 1 bar i koristi se poluizotropna shema spajanja pritiska. U procesu balansiranja i proizvodnje, termostat (61) sa ponovnom kalibracijom brzine se koristi za spajanje temperature proteinskih, lipidnih i čestica rastvarača. Tokom cijelog rada, ciljana temperatura je 310K. Interakcija bez vezivanja se izračunava generisanjem liste sparivanja korištenjem Verletove sheme sa tolerancijom pufera od 0,005. Coulombov član se izračunava korištenjem reakcijskog polja i granične udaljenosti od 1,1 nm. Vander Waalsov član koristi graničnu shemu sa graničnom udaljenosti od 1,1 nm, a Verletova granična shema se koristi za potencijalni drift (62).
Korištenjem VMD-a, granična talasna dužina između DOPC fosfatnih kuglica ili ceramidnih AM1 kuglica i proteina je 0,7 nm, a izračunava se broj lipida koji interaguju s proteinom. Prema sljedećoj formuli, izračunajte faktor osiromašenja-obogaćivanja (DE) kao u (63): DE faktor = (količina ukupnih lipida u proteinu 0,7) u proteinu 0,7 (količina Cer u ukupnim lipidima)
Prijavljena vrijednost se dobija kao prosjek, a intervali greške su četiri nezavisne kopije SE. Statistička značajnost DE faktora izračunava se t-testom [(prosječnaDE-faktor-1)/SE]. Izračunajte P vrijednost iz jednostrane distribucije.
Alat GROMACS je korišten za izračunavanje 2D lateralne mape gustoće sistema koji sadrži Emp24 unutar posljednjih 250 ns traga. Da bi se dobila mapa obogaćenja/osiromašenja ceramida, mapa gustoće Cer je podijeljena sa zbirom mape Cer i DOPC, a zatim podijeljena sa koncentracijom Cer u tijelu. Koristi se ista skala mape boja.
Za dodatne materijale za ovaj članak, pogledajte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod uslovima Creative Commons licence Attribution-Non-Commercial, koja dozvoljava korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, sve dok konačna upotreba nije u komercijalne svrhe i pretpostavka je da je originalno djelo ispravno. Referenca.
Napomena: Molimo vas da navedete svoju email adresu samo kako bi osoba koju preporučite stranici znala da želite da vidi email i da se ne radi o neželjenoj pošti. Nećemo prikupljati email adrese.
Ovo pitanje se koristi za provjeru da li ste posjetilac i sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
Sofija Rodriguez-Galardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valerija Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero-Romero, Anagiope Loz Romero - Ligione Loz Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D snimanje visoke rezolucije u realnom vremenu otkriva važnost dužine ceramidnog lanca za sortiranje proteina na selektivnim izlaznim mjestima.
Sofija Rodriguez-Galardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valerija Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero-Romero, Anagiope Loz Romero - Ligione Loz Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D snimanje visoke rezolucije u realnom vremenu otkriva važnost dužine ceramidnog lanca za sortiranje proteina na selektivnim izlaznim mjestima.
©2020 Američko udruženje za unapređenje nauke. sva prava pridržana. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.