Hvala vam što ste posjetili nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo korištenje najnovije verzije preglednika (ili isključivanje načina kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, ova stranica neće uključivati ​​stilove ili JavaScript.
Vodonik sulfid (H2S) ima višestruke fiziološke i patološke efekte na ljudski organizam. Natrijum hidrosulfid (NaHS) se široko koristi kao farmakološko sredstvo za procjenu efekata H2S u biološkim eksperimentima. Iako gubitak H2S iz rastvora NaHS traje samo nekoliko minuta, rastvori NaHS su korišteni kao donorski spojevi za H2S u vodi za piće u nekim studijama na životinjama. Ova studija je istraživala da li voda za piće sa koncentracijom NaHS od 30 μM, pripremljena u bocama za pacove/miševe, može ostati stabilna najmanje 12-24 sata, kako sugerišu neki autori. Pripremite rastvor NaHS (30 μM) u vodi za piće i odmah ga sipajte u boce za vodu za pacove/miševe. Uzorci su prikupljeni sa vrha i unutrašnjosti boce za vodu nakon 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 i 24 sata kako bi se izmjerio sadržaj sulfida metodom metilenskog plavog. Pored toga, mužjacima i ženkama pacova ubrizgavan je NaHS (30 μM) tokom dvije sedmice, a koncentracije sulfida u serumu mjerene su svaki drugi dan tokom prve sedmice i na kraju druge sedmice. Otopina NaHS u uzorku dobijenom s vrha boce za vodu bila je nestabilna; smanjila se za 72% i 75% nakon 12 i 24 sata. U uzorcima dobijenim iz unutrašnjosti boca za vodu, smanjenje NaHS nije bilo značajno unutar 2 sata; međutim, smanjilo se za 47% i 72% nakon 12 i 24 sata. Injekcija NaHS nije uticala na nivo sulfida u serumu kod mužjaka i ženki pacova. Zaključno, otopine NaHS pripremljene od vode za piće ne bi se trebale koristiti za doniranje H2S jer je otopina nestabilna. Ovaj način primjene će izložiti životinje nepravilnim i manjim od očekivanih količinama NaHS.
Sumporovodik (H2S) se koristi kao toksin od 1700. godine; međutim, njegovu moguću ulogu kao endogenog biosignalnog molekula opisali su Abe i Kimura 1996. godine. Tokom protekle tri decenije, razjašnjene su brojne funkcije H2S u različitim ljudskim sistemima, što je dovelo do spoznaje da molekuli donori H2S mogu imati kliničku primjenu u liječenju ili upravljanju određenim bolestima; pogledajte Chirino i saradnike za nedavni pregled.
Natrijum hidrosulfid (NaHS) se široko koristi kao farmakološko sredstvo za procjenu efekata H2S u mnogim studijama na ćelijskim kulturama i životinjama5,6,7,8. Međutim, NaHS nije idealan donor H2S jer se brzo pretvara u H2S/HS- u rastvoru, lako se kontaminira polisulfidima i lako oksidira i isparava4,9. U mnogim biološkim eksperimentima, NaHS se rastvara u vodi, što rezultira pasivnim isparavanjem i gubitkom H2S10,11,12, spontanom oksidacijom H2S11,12,13 i fotolizom14. Sulfid u originalnom rastvoru se vrlo brzo gubi zbog isparavanja H2S11. U otvorenoj posudi, vrijeme poluraspada (t1/2) H2S je oko 5 minuta, a njegova koncentracija se smanjuje za oko 13% u minuti10. Iako gubitak vodonik sulfida iz rastvora NaHS traje samo nekoliko minuta, neke studije na životinjama su koristile rastvore NaHS kao izvor vodonik sulfida u vodi za piće tokom 1-21 sedmice, zamjenjujući rastvor koji sadrži NaHS svakih 12-24 sata.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Ova praksa nije u skladu s principima naučnog istraživanja, budući da bi doze lijekova trebale biti zasnovane na njihovoj upotrebi kod drugih vrsta, posebno ljudi.27
Predklinička istraživanja u biomedicini imaju za cilj poboljšanje kvalitete njege pacijenata ili ishoda liječenja. Međutim, rezultati većine studija na životinjama još nisu primijenjeni na ljude28,29,30. Jedan od razloga za ovaj neuspjeh u prevođenju je nedostatak pažnje posvećene metodološkom kvalitetu studija na životinjama30. Stoga je cilj ove studije bio istražiti mogu li otopine NaHS od 30 μM pripremljene u bocama za vodu za pacove/miševe ostati stabilne u vodi za piće 12-24 sata, kako se tvrdi ili sugerira u nekim studijama.
Svi eksperimenti u ovoj studiji provedeni su u skladu s objavljenim smjernicama za njegu i korištenje laboratorijskih životinja u Iranu31. Svi eksperimentalni izvještaji u ovoj studiji također su slijedili smjernice ARRIVE32. Etički komitet Instituta za endokrine nauke Medicinskog univerziteta Shahid Beheshti odobrio je sve eksperimentalne procedure u ovoj studiji.
Cink acetat dihidrat (CAS: 5970-45-6) i bezvodni željezni hlorid (CAS: 7705-08-0) kupljeni su od Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Francuska). Natrijum hidrosulfid hidrat (CAS: 207683-19-0) i N,N-dimetil-p-fenilendiamin (DMPD) (CAS: 535-47-0) kupljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Izofluran je kupljen od Piramal (Bethlehem, PA, SAD). Hlorovodonična kiselina (HCl) je kupljena od Merck (Darmstadt, Njemačka).
Pripremite rastvor NaHS (30 μM) u vodi za piće i odmah ga sipajte u boce za vodu za pacove/miševe. Ova koncentracija je odabrana na osnovu brojnih publikacija koje koriste NaHS kao izvor H2S; pogledajte odjeljak Diskusija. NaHS je hidratizirani molekul koji može sadržavati različite količine hidratacijske vode (tj. NaHS•xH2O); prema proizvođaču, postotak NaHS korištenog u našoj studiji bio je 70,7% (tj. NaHS•1,3 H2O), i mi smo ovu vrijednost uzeli u obzir u našim proračunima, gdje smo koristili molekularnu težinu od 56,06 g/mol, što je molekularna težina bezvodnog NaHS. Hidratacijska voda (također se naziva kristalizacijska voda) su molekule vode koje čine kristalnu strukturu33. Hidrati imaju različita fizička i termodinamička svojstva u poređenju s anhidratima34.
Prije dodavanja NaHS u vodu za piće, izmjerite pH i temperaturu rastvarača. Odmah sipajte rastvor NaHS u bocu za vodu za pacove/miševe u kavezu za životinje. Uzorci su prikupljeni s vrha i iz unutrašnjosti boce za vodu u 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 i 24 sata kako bi se izmjerio sadržaj sulfida. Mjerenja sulfida su izvršena odmah nakon svakog uzorkovanja. Uzorke smo dobili s vrha epruvete jer su neke studije pokazale da mala veličina pora cijevi za vodu može smanjiti isparavanje H2S15,19. Čini se da se ovaj problem odnosi i na rastvor u boci. Međutim, to nije bio slučaj s rastvorom u grlu boce za vodu, koji je imao veću brzinu isparavanja i bio je autooksidirajući; u stvari, životinje su prvo pile ovu vodu.
U studiji su korišteni mužjaci i ženke Wistar pacova. Pacovi su smješteni u polipropilenske kaveze (2-3 pacova po kavezu) pod standardnim uslovima (temperatura 21-26 °C, vlažnost 32-40%) sa 12 sati svjetla (od 7 do 19 sati) i 12 sati mraka (od 19 do 7 sati). Pacovi su imali slobodan pristup vodi iz slavine i hranjeni su standardnom hranom (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran). Ženke (n=10, tjelesna težina: 190-230 g) i mužjaci (n=10, tjelesna težina: 320-370 g) Wistar pacova, odgovarajuće dobi (6 mjeseci), nasumično su podijeljeni u kontrolnu grupu i grupu tretiranu NaHS (30 μM) (n=5 po grupi). Za određivanje veličine uzorka koristili smo KISS (Keep It Simple, Stupid) pristup, koji kombinuje prethodno iskustvo i analizu snage35. Prvo smo proveli pilot studiju na 3 pacova i odredili prosječni nivo ukupnog sulfida u serumu i standardnu ​​devijaciju (8,1 ± 0,81 μM). Zatim, uzimajući u obzir snagu od 80% i pretpostavljajući dvostrani nivo značajnosti od 5%, odredili smo preliminarnu veličinu uzorka (n = 5 na osnovu prethodne literature) koja je odgovarala standardiziranoj veličini efekta od 2,02 sa unaprijed definiranom vrijednošću koju je predložio Festing za izračunavanje veličine uzorka eksperimentalnih životinja35. Nakon množenja ove vrijednosti sa SD (2,02 × 0,81), predviđena veličina detektabilnog efekta (1,6 μM) bila je 20%, što je prihvatljivo. To znači da je n = 5/grupa dovoljna za detekciju prosječne promjene od 20% između grupa. Pacovi su nasumično podijeljeni u kontrolne i grupe tretirane NaSH koristeći funkciju slučajnog odabira Excel softvera36 (Dopunska slika 1). Zasljepljivanje je provedeno na nivou ishoda, a istraživači koji su provodili biohemijska mjerenja nisu bili svjesni dodjeljivanja grupa.
NaHS grupe oba spola tretirane su sa 30 μM NaHS rastvorom pripremljenim u vodi za piće tokom 2 sedmice; Svježi rastvor je davan svakih 24 sata, tokom kojih je mjerena tjelesna težina. Uzorci krvi su prikupljeni sa vrhova repova svih pacova pod izofluranskom anestezijom svaki drugi dan na kraju prve i druge sedmice. Uzorci krvi su centrifugirani na 3000 g tokom 10 minuta, serum je odvojen i pohranjen na -80°C za naknadno mjerenje serumske uree, kreatinina (Cr) i ukupnog sulfida. Serumska urea je određena enzimskom ureaznom metodom, a serumski kreatinin je određen fotometrijskom Jaffe metodom korištenjem komercijalno dostupnih kompleta (Man Company, Teheran, Iran) i automatskog analizatora (Selectra E, serijski broj 0-2124, Holandija). Intra- i inter-analitički koeficijenti varijacije za ureu i Cr bili su manji od 2,5%.
Metoda metilenskog plavog (MB) koristi se za mjerenje ukupnog sulfida u vodi za piće i serumu koji sadrži NaHS; MB je najčešće korištena metoda za mjerenje sulfida u rasutim rastvorima i biološkim uzorcima11,37. MB metoda se može koristiti za procjenu ukupnog skupa sulfida38 i mjerenje neorganskih sulfida u obliku H2S, HS- i S2 u vodenoj fazi39. U ovoj metodi, sumpor se taloži kao cink sulfid (ZnS) u prisustvu cink acetata11,38. Taloženje cink acetatom je najčešće korištena metoda za odvajanje sulfida od drugih hromofora11. ZnS je ponovo rastvoren pomoću HCl11 pod jako kiselim uslovima. Sulfid reaguje sa DMPD u stehiometrijskom omjeru 1:2 u reakciji kataliziranoj željeznim hloridom (Fe3+ djeluje kao oksidacijsko sredstvo) da bi se formirala boja MB, koja se spektrofotometrijski detektuje na 670 nm40,41. Granica detekcije MB metode je približno 1 μM11.
U ovoj studiji, 100 μL svakog uzorka (rastvor ili serum) dodano je u epruvetu; zatim je dodano 200 μL cink acetata (1% w/v u destilovanoj vodi), 100 μL DMPD-a (20 mM u 7,2 M HCl) i 133 μL FeCl3 (30 mM u 1,2 M HCl). Smjesa je inkubirana na 37°C u mraku tokom 30 minuta. Rastvor je centrifugiran na 10.000 g tokom 10 minuta, a apsorbancija supernatanta je očitana na 670 nm pomoću čitača mikroploča (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, SAD). Koncentracije sulfida određene su pomoću kalibracijske krivulje NaHS (0–100 μM) u ddH2O (Dodatna slika 2). Svi rastvori korišteni za mjerenja bili su svježe pripremljeni. Koeficijenti varijacije unutar i između testova za mjerenja sulfida bili su 2,8% odnosno 3,4%. Također smo odredili ukupni sulfid izoliran iz uzoraka vode za piće i seruma koji sadrže natrijum tiosulfat koristeći metodu obogaćenog uzorka42. Iskorištenje za uzorke vode za piće i seruma koji sadrže natrijum tiosulfat bilo je 91 ± 1,1% (n = 6) odnosno 93 ± 2,4% (n = 6).
Statistička analiza je provedena korištenjem GraphPad Prism softvera verzije 8.0.2 za Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD, www.graphpad.com). Za poređenje temperature i pH vrijednosti vode za piće prije i nakon dodavanja NaHS korišten je t-test za uparivanje. Gubitak H2S u rastvoru koji sadrži NaHS izračunat je kao procentualno smanjenje u odnosu na početni unos, a da bismo procijenili da li je gubitak statistički značajan, proveli smo jednosmjernu ANOVA s ponovljenim mjerenjima, nakon čega je uslijedio Dunnettov test višestruke usporedbe. Tjelesna težina, urea u serumu, kreatinin u serumu i ukupni sulfid u serumu tokom vremena upoređeni su između kontrolnih i pacova različitih spolova tretiranih NaHS korištenjem dvosmjerne mješovite (između-unutar) ANOVA, nakon čega je uslijedio Bonferroni post hoc test. Dvostrane P vrijednosti < 0,05 smatrane su statistički značajnim.
pH vrijednost vode za piće bila je 7,60 ± 0,01 prije dodavanja NaHS i 7,71 ± 0,03 nakon dodavanja NaHS (n = 13, p = 0,0029). Temperatura vode za piće bila je 26,5 ± 0,2 i smanjila se na 26,2 ± 0,2 nakon dodavanja NaHS (n = 13, p = 0,0128). Pripremite rastvor NaHS od 30 μM u vodi za piće i čuvajte ga u boci za vodu. Rastvor NaHS je nestabilan i njegova koncentracija se s vremenom smanjuje. Prilikom uzorkovanja iz grla boce za vodu, uočeno je značajno smanjenje (68,0%) u prvom satu, a sadržaj NaHS u rastvoru smanjio se za 72% i 75% nakon 12 i 24 sata. U uzorcima dobijenim iz boca za vodu, smanjenje NaHS nije bilo značajno do 2 sata, ali nakon 12 i 24 sata smanjilo se za 47% i 72%. Ovi podaci ukazuju na to da se procenat NaHS u rastvoru od 30 μM pripremljenom u vodi za piće smanjio na približno jednu četvrtinu početne vrijednosti nakon 24 sata, bez obzira na lokaciju uzorkovanja (Slika 1).
Stabilnost rastvora NaHS (30 μM) u vodi za piće u bocama za pacove/miševe. Nakon pripreme rastvora, uzorci su uzeti sa vrha i unutrašnjosti boce za vodu. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD (n = 6/grupa). * i #, P < 0,05 u poređenju sa vremenom 0. Fotografija boce za vodu prikazuje vrh (sa otvorom) i tijelo boce. Volumen vrha je približno 740 μL.
Koncentracija NaHS u svježe pripremljenom rastvoru od 30 μM bila je 30,3 ± 0,4 μM (raspon: 28,7–31,9 μM, n = 12). Međutim, nakon 24 sata, koncentracija NaHS se smanjila na nižu vrijednost (prosjek: 3,0 ± 0,6 μM). Kao što je prikazano na Slici 2, koncentracije NaHS kojima su pacovi bili izloženi nisu bile konstantne tokom perioda istraživanja.
Tjelesna težina ženki pacova značajno se povećala tokom vremena (sa 205,2 ± 5,2 g na 213,8 ​​± 7,0 g u kontrolnoj grupi i sa 204,0 ± 8,6 g na 211,8 ± 7,5 g u grupi tretiranoj NaHS-om); međutim, tretman NaHS-om nije imao utjecaja na tjelesnu težinu (Slika 3). Tjelesna težina mužjaka pacova značajno se povećala tokom vremena (sa 338,6 ± 8,3 g na 352,4 ± 6,0 g u kontrolnoj grupi i sa 352,4 ± 5,9 g na 363,2 ± 4,3 g u grupi tretiranoj NaHS-om); međutim, tretman NaHS-om nije imao utjecaja na tjelesnu težinu (Slika 3).
Promjene tjelesne težine kod ženki i mužjaka pacova nakon primjene NaHS (30 μM). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM i upoređeni su korištenjem dvosmjerne mješovite (unutar-između) analize varijanse s Bonferroni post hoc testom. n = 5 svakog spola u svakoj grupi.
Koncentracije uree i kreatin fosfata u serumu bile su uporedive kod kontrolnih i pacova tretiranih NaSH tokom cijele studije. Nadalje, tretman NaSH nije uticao na koncentracije uree i kreatinhroma u serumu (Tabela 1).
Osnovne koncentracije ukupnog sulfida u serumu bile su uporedive između kontrolnih i mužjaka (8,1 ± 0,5 μM u odnosu na 9,3 ± 0,2 μM) i ženki (9,1 ± 1,0 μM u odnosu na 6,1 ± 1,1 μM) pacova tretiranih NaHS-om. Primjena NaHS-a tokom 14 dana nije imala utjecaja na nivo ukupnog sulfida u serumu ni kod mužjaka ni kod ženki pacova (Slika 4).
Promjene u ukupnim koncentracijama sulfida u serumu kod mužjaka i ženki pacova nakon primjene NaHS (30 μM). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM i upoređeni su korištenjem dvosmjerne mješovite (unutar-unutar) analize varijanse s Bonferroni post hoc testom. Svaki spol, n = 5/grupa.
Glavni zaključak ove studije je da je voda za piće koja sadrži NaHS nestabilna: samo oko četvrtine početnog ukupnog sadržaja sulfida može se detektovati 24 sata nakon uzorkovanja s vrha i unutrašnjosti boca za vodu za pacove/miševe. Nadalje, pacovi su bili izloženi nestabilnim koncentracijama NaHS zbog gubitka H2S u rastvoru NaHS, a dodavanje NaHS u vodu za piće nije uticalo na tjelesnu težinu, serumsku ureu i kreatin hrom, niti na ukupni serumski sulfid.
U ovoj studiji, brzina gubitka H2S iz 30 μM NaHS rastvora pripremljenih u vodi za piće bila je približno 3% na sat. U puferovanom rastvoru (100 μM natrijum sulfida u 10 mM PBS, pH 7,4), zabilježeno je da se koncentracija sulfida smanjila za 7% tokom vremena tokom 8 sati11. Prethodno smo branili intraperitonealnu primjenu NaHS izvještavajući da je brzina gubitka sulfida iz 54 μM NaHS rastvora u vodi za piće bila približno 2,3% na sat (4%/sat u prvih 12 sati i 1,4%/sat u posljednjih 12 sati nakon pripreme)8. Ranije studije43 su otkrile konstantan gubitak H2S iz NaHS rastvora, prvenstveno zbog isparavanja i oksidacije. Čak i bez dodavanja mjehurića, sulfid u osnovnom rastvoru se brzo gubi zbog isparavanja H2S11. Studije su pokazale da se tokom procesa razrjeđivanja, koji traje oko 30-60 sekundi, oko 5-10% H2S gubi zbog isparavanja6. Kako bi spriječili isparavanje H2S iz rastvora, istraživači su poduzeli nekoliko mjera, uključujući lagano miješanje rastvora12, pokrivanje osnovnog rastvora plastičnom folijom6 i minimiziranje izlaganja rastvora zraku, budući da brzina isparavanja H2S ovisi o granici zrak-tekućina.13 Spontana oksidacija H2S nastaje uglavnom zbog iona prelaznih metala, posebno željeza (III), koji su nečistoće u vodi.13 Oksidacija H2S rezultira stvaranjem polisulfida (atomi sumpora povezani kovalentnim vezama)11. Da bi se izbjegla njegova oksidacija, rastvori koji sadrže H2S pripremaju se u deoksigeniranim rastvaračima44,45, a zatim se pročišćavaju argonom ili dušikom 20-30 minuta kako bi se osigurala deoksigenacija.11,12,37,44,45,46 Dietilentriaminpentasirćetna kiselina (DTPA) je kelator metala (10-4 M) koji sprječava autooksidaciju HS u aerobnim rastvorima. U odsustvu DTPA, brzina autooksidacije HS- je približno 50% tokom približno 3 sata na 25°C37,47. Nadalje, budući da je oksidacija 1e-sulfida katalizirana ultraljubičastim svjetlom, otopinu treba čuvati na ledu i zaštititi od svjetlosti11.
Kao što je prikazano na Slici 5, NaHS disocira na Na+ i HS-6 kada se rastvori u vodi; ova disocijacija je određena pK1 reakcije, koja zavisi od temperature: pK1 = 3,122 + 1132/T, gdje se T kreće od 5 do 30°C i mjeri se u stepenima Kelvina (K), K = °C + 273,1548. HS- ima visok pK2 (pK2 = 19), tako da se pri pH < 96,49 S2- ne formira ili se formira u vrlo malim količinama. Nasuprot tome, HS- djeluje kao baza i prihvata H+ iz molekule H2O, a H2O djeluje kao kiselina i pretvara se u H2S i OH-.
Formiranje rastvorenog H2S gasa u rastvoru NaHS (30 µM). aq, vodeni rastvor; g, gas; l, tečnost. Svi proračuni pretpostavljaju da je pH vode = 7,0 i temperatura vode = 20 °C. Kreirano sa BioRender.com.
Uprkos dokazima da su rastvori NaHS nestabilni, nekoliko studija na životinjama koristilo je rastvore NaHS u vodi za piće kao donor H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 sa trajanjem intervencije u rasponu od 1 do 21 sedmice (Tabela 2). Tokom ovih studija, rastvor NaHS je obnavljan svakih 12 sati, 15, 17, 18, 24, 25 sati ili 24 sata, 19, 20, 21, 22, 23 sata. Naši rezultati su pokazali da su pacovi bili izloženi nestabilnim koncentracijama lijeka zbog gubitka H2S iz rastvora NaHS, a sadržaj NaHS u vodi za piće pacova je značajno fluktuirao tokom 12 ili 24 sata (vidi Sliku 2). Dvije od ovih studija su izvijestile da su nivoi H2S u vodi ostali stabilni tokom 24 sata22 ili da su uočeni samo gubici H2S od 2-3% tokom 12 sati15, ali nisu pružile prateće podatke ili detalje mjerenja. Dvije studije su pokazale da mali promjer boca za vodu može smanjiti isparavanje H2S15,19. Međutim, naši rezultati su pokazali da ovo može odgoditi gubitak H2S iz boce za vodu samo za 2 sata, a ne za 12-24 sata. Obje studije napominju da pretpostavljamo da se nivo NaHS u vodi za piće nije promijenio jer nismo primijetili promjenu boje vode; stoga, oksidacija H2S zrakom nije bila značajna19,20. Iznenađujuće, ova subjektivna metoda procjenjuje stabilnost NaHS u vodi, a ne mjeri promjenu njegove koncentracije tokom vremena.
Gubitak H2S u rastvoru NaHS povezan je sa pH i temperaturom. Kao što je navedeno u našoj studiji, rastvaranje NaHS u vodi rezultira stvaranjem alkalnog rastvora50. Kada se NaHS rastvori u vodi, stvaranje rastvorenog H2S gasa zavisi od pH vrijednosti6. Što je niži pH rastvora, to je veći udio NaHS prisutnog kao molekula H2S gasa i više sulfida se gubi iz vodenog rastvora11. Nijedna od ovih studija nije izvijestila o pH vrijednosti vode za piće koja se koristi kao rastvarač za NaHS. Prema preporukama SZO, koje usvaja većina zemalja, pH vode za piće treba da bude u rasponu od 6,5–8,551. U ovom pH rasponu, brzina spontane oksidacije H2S se povećava približno deset puta13. Rastvaranje NaHS u vodi u ovom pH rasponu rezultiraće koncentracijom rastvorenog H2S gasa od 1 do 22,5 μM, što naglašava važnost praćenja pH vrijednosti vode prije rastvaranja NaHS. Osim toga, temperaturni raspon naveden u gornjoj studiji (18–26 °C) rezultirao bi promjenom koncentracije rastvorenog H2S plina u otopini od približno 10%, budući da promjene temperature mijenjaju pK1, a male promjene pK1 mogu imati značajan utjecaj na koncentraciju rastvorenog H2S plina48. Osim toga, dugo trajanje nekih studija (5 mjeseci)22, tokom kojih se očekuje velika varijabilnost temperature, također pogoršava ovaj problem.
Sve studije osim jedne21 koristile su rastvor NaHS od 30 μM u vodi za piće. Da bi objasnili korištenu dozu (tj. 30 μM), neki autori su istakli da NaHS u vodenoj fazi proizvodi potpuno istu koncentraciju H2S gasa i da je fiziološki raspon H2S od 10 do 100 μM, tako da je ova doza unutar fiziološkog raspona15,16. Drugi su objasnili da 30 μM NaHS može održavati nivo H2S u plazmi unutar fiziološkog raspona, tj. 5–300 μM19,20. Uzimamo u obzir koncentraciju NaHS u vodi od 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), koja je korištena u nekim studijama za proučavanje efekata H2S. Možemo izračunati da je koncentracija rastvorenog H2S gasa 14,7 μM, što je oko 50% početne koncentracije NaHS. Ova vrijednost je slična vrijednosti koju su izračunali drugi autori pod istim uslovima13,48.
U našoj studiji, primjena NaHS nije promijenila tjelesnu težinu; ovaj rezultat je u skladu s rezultatima drugih studija na mužjacima miševa22,23 i mužjacima pacova18; Međutim, dvije studije su izvijestile da je NaSH obnovio smanjenu tjelesnu težinu kod nefrektomiranih pacova24,26, dok druge studije nisu izvijestile o učinku primjene NaSH na tjelesnu težinu15,16,17,19,20,21,25. Nadalje, u našoj studiji, primjena NaSH nije utjecala na nivoe uree i kreatin hroma u serumu, što je u skladu s rezultatima drugog izvještaja25.
Studija je otkrila da dodavanje NaHS u vodu za piće tokom 2 sedmice nije uticalo na ukupne koncentracije sulfida u serumu kod mužjaka i ženki pacova. Ovaj nalaz je u skladu sa rezultatima Sen i saradnika (16): 8 sedmica tretmana sa 30 μM NaHS u vodi za piće nije uticalo na nivoe sulfida u plazmi kod kontrolnih pacova; međutim, izvijestili su da je ova intervencija obnovila smanjene nivoe H2S u plazmi nefrektomiranih miševa. Li i saradnici (22) također su izvijestili da je tretman sa 30 μM NaHS u vodi za piće tokom 5 mjeseci povećao nivoe slobodnog sulfida u plazmi kod starijih miševa za oko 26%. Druge studije nisu izvijestile o promjenama u cirkulišućem sulfidu nakon dodavanja NaHS u vodu za piće.
Sedam studija je koristilo Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, ali nisu pružile daljnje detalje o hidratacijskoj vodi, a pet studija nije spomenulo izvor NaHS korištenog u njihovim metodama pripreme17,18,24,25,26. NaHS je hidratizirana molekula i njen sadržaj hidratacijske vode može varirati, što utječe na količinu NaHS potrebnu za pripremu otopine date molarnosti. Na primjer, sadržaj NaHS u našoj studiji bio je NaHS•1,3 H2O. Stoga, stvarne koncentracije NaHS u ovim studijama mogu biti niže od onih koje su prijavljene.
„Kako tako kratkotrajni spoj može imati tako dugotrajan učinak?“ Pozgay i saradnici21 postavili su ovo pitanje prilikom procjene učinaka NaHS na kolitis kod miševa. Nadaju se da će buduće studije moći odgovoriti na ovo pitanje i nagađaju da NaHS otopine mogu sadržavati stabilnije polisulfide pored H2S i disulfida koji posreduju u učinku NaHS21. Druga mogućnost je da vrlo niske koncentracije NaHS koje ostaju u otopini također mogu imati blagotvoran učinak. U stvari, Olson i saradnici su pružili dokaze da mikromolarni nivoi H2S u krvi nisu fiziološki i da bi trebali biti u nanomolarnom rasponu ili potpuno odsutni13. H2S može djelovati putem sulfacije proteina, reverzibilne posttranslacijske modifikacije koja utječe na funkciju, stabilnost i lokalizaciju mnogih proteina52,53,54. U stvari, pod fiziološkim uvjetima, približno 10% do 25% mnogih proteina jetre je sulfilirano53. Obje studije priznaju brzo uništavanje NaHS19,23 ali iznenađujuće navode da smo „kontrolirali koncentraciju NaHS u vodi za piće tako što smo ga svakodnevno zamjenjivali.“23 Jedna studija je slučajno navela da je „NaHS standardni donor H2S i da se često koristi u kliničkoj praksi za zamjenu samog H2S.“18
Gornja diskusija pokazuje da se NaHS gubi iz rastvora isparavanjem, oksidacijom i fotolizom, te su stoga dati neki prijedlozi za smanjenje gubitka H2S iz rastvora. Prvo, isparavanje H2S zavisi od granice gas-tečnost13 i pH rastvora11; stoga, da bi se minimizirao gubitak isparavanjem, grlić boce za vodu može se napraviti što manjim, kao što je prethodno opisano15,19, a pH vode se može podesiti na prihvatljivu gornju granicu (tj. 6,5–8,551) kako bi se minimizirao gubitak isparavanjem11. Drugo, spontana oksidacija H2S nastaje zbog djelovanja kisika i prisustva iona prelaznih metala u vodi za piće13, tako da deoksigenacija vode za piće argonom ili dušikom44,45 i upotreba helatora metala37,47 mogu smanjiti oksidaciju sulfida. Treće, da bi se spriječila fotodekompozicija H2S, boce za vodu mogu se omotati aluminijskom folijom; Ova praksa se primjenjuje i na materijale osjetljive na svjetlost kao što je streptozotocin55. Konačno, neorganske sulfidne soli (NaHS, Na2S i CaS) mogu se davati putem gavaže, umjesto da se rastvaraju u vodi za piće, kao što je prethodno objavljeno56,57,58; studije su pokazale da se radioaktivni natrijum sulfid koji se daje pacovima putem gavaže dobro apsorbuje i distribuira u gotovo sva tkiva59. Do danas je većina studija davala neorganske sulfidne soli intraperitonealno; međutim, ovaj put se rijetko koristi u kliničkim uslovima60. S druge strane, oralni put je najčešći i preferirani put primjene kod ljudi61. Stoga preporučujemo procjenu učinaka donora H2S kod glodara oralnom gavažom.
Ograničenje je to što smo sulfid u vodenom rastvoru i serumu mjerili MB metodom. Metode za mjerenje sulfida uključuju titraciju joda, spektrofotometriju, elektrohemijsku metodu (potenciometrija, amperometrija, kulometrijska metoda i amperometrijska metoda) i hromatografiju (gasna hromatografija i visokoefikasna tečna hromatografija), među kojima je najčešće korištena metoda MB spektrofotometrijska metoda62. Ograničenje MB metode za mjerenje H2S u biološkim uzorcima je to što mjeri sva jedinjenja koja sadrže sumpor, a ne i slobodni H2S63 jer se izvodi u kiselim uslovima, što rezultira ekstrakcijom sumpora iz biološkog izvora64. Međutim, prema Američkom udruženju za javno zdravstvo, MB je standardna metoda za mjerenje sulfida u vodi65. Stoga ovo ograničenje ne utiče na naše glavne rezultate o nestabilnosti rastvora koji sadrže NaHS. Nadalje, u našoj studiji, oporavak mjerenja sulfida u uzorcima vode i seruma koji sadrže NaHS bio je 91% odnosno 93%. Ove vrijednosti su u skladu sa prethodno objavljenim rasponima (77–92)66, što ukazuje na prihvatljivu analitičku preciznost42. Vrijedi napomenuti da smo koristili i mužjake i ženke pacova u skladu sa smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje (NIH) kako bismo izbjegli preveliko oslanjanje na studije na životinjama samo na mužjacima u predkliničkim studijama67 i kako bismo uključili i mužjake i ženke pacova kad god je to moguće68. Ovu činjenicu su naglasili i drugi69,70,71.
Zaključno, rezultati ove studije pokazuju da se rastvori NaHS pripremljeni od vode za piće ne mogu koristiti za generisanje H2S zbog njihove nestabilnosti. Ovaj put primjene bi izložio životinje nestabilnim i nižim od očekivanih nivoa NaHS; stoga se nalazi možda ne mogu primijeniti na ljude.
Skupovi podataka korišteni i/ili analizirani tokom trenutne studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.
Szabo, K. Hronologija istraživanja vodonik sulfida (H2S): od toksina iz okoliša do biološkog medijatora. Biohemija i farmakologija 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. i Kimura, H. Moguća uloga sumporovodika kao endogenog neuromodulatora. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. i Papapetropoulos, A. Fiziološka uloga vodonik sulfida u ćelijama, tkivima i organima sisara. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB i Kashfi, K. Razvoj potencijala ćelijskih sistema za isporuku dušikovog oksida i vodikovog sulfida: nova era personalizirane medicine. Biohemija i farmakologija 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., et al. Dugotrajna primjena donora vodonik sulfida sa sporim oslobađanjem može spriječiti ishemiju/reperfuziju miokarda. Naučni izvještaji 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM i Hermann, A. Fosforilacija BK kanala reguliše osjetljivost na vodonik sulfid (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM i Hermann, A. Sumporovodik pojačava aktivnost kalcijumom aktiviranih kalijumskih (BK) kanala u tumorskim ćelijama hipofize pacova. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., et al. Sumporovodik pojačava zaštitni učinak nitrita protiv oštećenja miokarda uzrokovanih ishemijom-reperfuzijom kod pacova s ​​dijabetesom tipa 2. Nitric Oxide 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., et al. Trendovi u hemiji donora H2S i njen uticaj na kardiovaskularne bolesti. Antioksidansi 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF i Olson, KR (2012). Pasivni gubici sumporovodika u biološkim eksperimentima. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., et al. Hemijski aspekti mjerenja vodonik sulfida u fiziološkim uzorcima. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Spektrofotometrijsko određivanje sumporovodika u prirodnim vodama. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Praktična obuka iz hemije i biologije sumporovodika. „Antioksidansi.“ Redoks signalizacija. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).