Prethodno smo izvijestili da su serumski nivoi metabolita triptofana iz crijeva, indol-3-propionske kiseline (IPA), niži kod pacijenata s fibrozom jetre. U ovoj studiji istražili smo transkriptom i DNK metilom u gojaznim jetrama u odnosu na serumske nivoe IPA, kao i ulogu IPA u indukciji fenotipske inaktivacije jetrenih stelatnih ćelija (HSC) in vitro.
Studija je obuhvatila 116 gojaznih pacijenata bez dijabetesa melitusa tipa 2 (T2DM) (starosti 46,8 ± 9,3 godine; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) koji su podvrgnuti barijatrijskoj hirurgiji u Centru za barijatrijsku hirurgiju u Kuopiu (KOBS). Nivoi IPA u cirkulaciji mjereni su tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom (LC-MS), analiza transkriptoma jetre provedena je sekvenciranjem ukupne RNK, a analiza metilacije DNK provedena je pomoću Infinium HumanMethylation450 BeadChip-a. Za in vitro eksperimente korištene su ljudske stelatne ćelije jetre (LX-2).
Serumski nivoi IPA korelirali su s ekspresijom gena uključenih u apoptotske, mitofagne i puteve dugovječnosti u jetri. Gen AKT serin/treonin kinaza 1 (AKT1) bio je najzastupljeniji i dominantni gen koji je interagirao u profilima transkripta jetre i metilacije DNK. Tretman IPA-om izazvao je apoptozu, smanjio mitohondrijalno disanje i promijenio morfologiju ćelija i mitohondrijalnu dinamiku modulirajući ekspresiju gena za koje se zna da regulišu fibrozu, apoptozu i preživljavanje LX-2 ćelija.
Uzeti zajedno, ovi podaci podržavaju tvrdnju da IPA ima potencijalne terapijske efekte i da može izazvati apoptozu i pomaknuti HSC fenotip prema neaktivnom stanju, čime se proširuje mogućnost inhibicije fibroze jetre ometanjem aktivacije HSC i metabolizma mitohondrija.
Prevalencija gojaznosti i metaboličkog sindroma povezana je sa sve većom učestalošću metabolički povezane masne bolesti jetre (MASLD); bolest pogađa 25% do 30% opće populacije [1]. Glavna posljedica MASLD etiologije je fibroza jetre, dinamičan proces karakteriziran kontinuiranom akumulacijom vlaknastog ekstracelularnog matriksa (ECM) [2]. Glavne ćelije uključene u fibrozu jetre su hepatičke stelatne ćelije (HSC), koje pokazuju četiri poznata fenotipa: mirujuće, aktivirane, inaktivirane i senescentne [3, 4]. HSC se mogu aktivirati i transdiferencirati iz mirujućeg oblika u proliferativne ćelije slične fibroblastima s visokim energetskim potrebama, s povećanom ekspresijom α-glatkog mišićnog aktina (α-SMA) i kolagena tipa I (Col-I) [5, 6]. Tokom preokreta fibroze jetre, aktivirane HSC se eliminiraju putem apoptoze ili inaktivacije. Ovi procesi uključuju smanjenje fibrogenih gena i modulaciju gena koji doprinose preživljavanju (kao što su signalni putevi NF-κB i PI3K/Akt) [7, 8], kao i promjene u dinamici i funkciji mitohondrija [9].
Utvrđeno je da su serumski nivoi metabolita triptofana, indol-3-propionske kiseline (IPA), koji se proizvodi u crijevima, smanjeni kod metaboličkih bolesti kod ljudi, uključujući MASLD [10–13]. IPA je povezan s unosom dijetalnih vlakana, poznat je po svojim antioksidativnim i protuupalnim efektima te ublažava fenotip nealkoholnog steatohepatitisa (NASH) izazvanog prehranom in vivo i in vitro [11–14]. Neki dokazi dolaze iz naše prethodne studije, koja je pokazala da su serumski nivoi IPA bili niži kod pacijenata s fibrozom jetre nego kod gojaznih pacijenata bez fibroze jetre u studiji Kuopio Bariatric Surgery (KOBS). Nadalje, pokazali smo da tretman IPA može smanjiti ekspresiju gena koji su klasični markeri adhezije ćelija, migracije ćelija i aktivacije hematopoetskih matičnih ćelija u modelu ljudskih zvjezdastih ćelija jetre (LX-2) i da je potencijalni hepatoprotektivni metabolit [15]. Međutim, ostaje nejasno kako IPA inducira regresiju fibroze jetre aktiviranjem apoptoze HSC i mitohondrijske bioenergetike.
Ovdje pokazujemo da je serumski IPA povezan s ekspresijom gena obogaćenih apoptozom, mitofagijom i putevima dugovječnosti u jetri gojaznih osoba koje nemaju dijabetes tipa 2 (KOBS). Nadalje, otkrili smo da IPA može inducirati uklanjanje i razgradnju aktiviranih hematopoetskih matičnih ćelija (HSC) putem puta inaktivacije. Ovi rezultati otkrivaju novu ulogu IPA, što ga čini potencijalnom terapijskom metom za poticanje regresije fibroze jetre.
Prethodna studija u KOBS kohorti pokazala je da pacijenti s fibrozom jetre imaju niže nivoe IPA u cirkulaciji u poređenju s pacijentima bez fibroze jetre [15]. Kako bismo isključili potencijalni zbunjujući učinak dijabetesa tipa 2, regrutirali smo 116 gojaznih pacijenata bez dijabetesa tipa 2 (prosječna dob ± SD: 46,8 ± 9,3 godine; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabela 1) iz tekuće KOBS studije kao populaciju za studiju [16]. Svi učesnici su dali pismeni informirani pristanak, a protokol studije odobrio je Etički komitet bolnice okruga Sjeverni Savo u skladu s Helsinškom deklaracijom (54/2005, 104/2008 i 27/2010).
Uzorci biopsije jetre su uzeti tokom barijatrijske hirurgije i histološki su ih procijenili iskusni patolozi prema prethodno opisanim kriterijima [17, 18]. Kriteriji procjene su sažeti u Dodatnoj tabeli S1 i prethodno su opisani [19].
Uzorci seruma natašte analizirani su neciljanom tekućinskom hromatografijom-masenom spektrometrijom (LC-MS) za metabolomsku analizu (n = 116). Uzorci su analizirani korištenjem UHPLC-qTOF-MS sistema (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Njemačka) kao što je prethodno opisano19. Identifikacija izopropil alkohola (IPA) zasnovana je na vremenu zadržavanja i poređenju MS/MS spektra sa čistim standardima. Intenzitet IPA signala (površina vrha) uzet je u obzir u svim daljnjim analizama [20].
Sekvenciranje cijele RNK jetre provedeno je korištenjem Illumina HiSeq 2500 uređaja, a podaci su prethodno obrađeni kako je prethodno opisano [19, 21, 22]. Izvršili smo ciljanu analizu diferencijalne ekspresije transkripata koji utiču na mitohondrijalnu funkciju/biogenezu koristeći 1957 gena odabranih iz baze podataka MitoMiner 4.0 [23]. Analiza metilacije DNK jetre provedena je korištenjem Infinium HumanMethylation450 BeadChip-a (Illumina, San Diego, CA, SAD) koristeći istu metodologiju kao što je prethodno opisano [24, 25].
Ljudske hepatičke stelatne ćelije (LX-2) ljubazno je ustupio prof. Stefano Romeo, a kultivirane su i održavane u DMEM/F12 mediju (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Da bi se odabrala radna doza IPA, LX-2 ćelije su tretirane različitim koncentracijama IPA (10 μM, 100 μM i 1 mM; Sigma, 220027) u DMEM/F12 mediju tokom 24 sata. Nadalje, da bi se istražila sposobnost IPA da inaktivira HSC, LX-2 ćelije su istovremeno tretirane sa 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) i 1 mM IPA u mediju bez seruma tokom 24 sata. Za odgovarajuće kontrole s nosačem, 4 nM HCl koji sadrži 0,1% BSA korišten je za tretman TGF-β1, a 0,05% DMSO za tretman IPA, a oba su korištena zajedno za kombinirani tretman.
Apoptoza je procijenjena korištenjem FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit-a sa 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, SAD, Cat# 640922) prema uputama proizvođača. Ukratko, LX-2 (1 × 105 ćelija/jažici) su kultivirane preko noći u pločama sa 12 jažica, a zatim tretirane višestrukim dozama IPA ili IPA i TGF-β1. Sljedećeg dana, plutajuće i adherentne ćelije su sakupljene, tripsinizirane, isprane PBS-om, resuspendirane u puferu za vezivanje Aneksa V i inkubirane sa FITC-Aneksinom V i 7-AAD tokom 15 minuta.
Mitohondrije u živim ćelijama su obojene na oksidativnu aktivnost korištenjem Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Za MTR testove, LX-2 ćelije su inkubirane pri jednakim gustoćama sa IPA i TGF-β1. Nakon 24 sata, žive ćelije su tripsinizirane, isprane sa PBS-om, a zatim inkubirane sa 100 μM MTR u mediju bez seruma na 37 °C tokom 20 minuta, kao što je prethodno opisano [26]. Za analizu morfologije živih ćelija, veličina ćelija i citoplazmatska složenost su analizirane korištenjem parametara direktnog raspršenja (FSC) i bočnog raspršenja (SSC).
Svi podaci (30.000 događaja) prikupljeni su korištenjem NovoCyte Quanteon (Agilent) i analizirani korištenjem softvera NovoExpress® 1.4.1 ili FlowJo V.10.
Brzina potrošnje kisika (OCR) i brzina ekstracelularne acidifikacije (ECAR) mjerene su u stvarnom vremenu pomoću Seahorse Extracellular Flux Analyzera (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) opremljenog Seahorse XF Cell Mito Stress uređajem prema uputama proizvođača. Ukratko, 2 × 104 LX-2 ćelija/jažici zasijano je na XF96 ploče za ćelijsku kulturu. Nakon inkubacije preko noći, ćelije su tretirane izopropanolom (IPA) i TGF-β1 (Dopunske metode 1). Analiza podataka provedena je korištenjem Seahorse XF Wave softvera, koji uključuje Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Iz ovoga je izračunat Bioenergetski zdravstveni indeks (BHI) [27].
Ukupna RNK je transkribirana u cDNK. Za specifične metode, pogledajte referencu [15]. Nivoi mRNA ljudskog 60S ribosomskog kiselog proteina P0 (RPLP0) i ciklofilina A1 (PPIA) korišteni su kao konstitutivne kontrole gena. Korišten je QuantStudio 6 pro Real-Time PCR sistem (Thermo Fisher, Landsmeer, Holandija) sa TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kitom (Applied Biosystems) ili Sensifast SYBR Lo-ROX Kitom (Bioline, BIO 94050), a relativni fold genske ekspresije izračunat je korištenjem komparativnih parametara ciklusa Ct vrijednosti (ΔΔCt) i metode ∆∆Ct. Detalji o prajmerima dati su u Dodatnim tabelama S2 i S3.
Nuklearna DNK (ncDNK) i mitohondrijska DNK (mtDNK) ekstrahirane su korištenjem DNeasy kompleta za krv i tkivo (Qiagen) kao što je prethodno opisano [28]. Relativna količina mtDNK izračunata je izračunavanjem omjera svake ciljne regije mtDNK i geometrijske sredine tri regije nuklearne DNK (mtDNK/ncDNK), kao što je detaljno opisano u Dodatnim metodama 2. Detalji o prajmerima za mtDNK i ncDNK dati su u Dodatnoj tabeli S4.
Žive ćelije su obojene sa Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) kako bi se vizualizirale međućelijske i unutarćelijske mitohondrijske mreže. LX-2 ćelije (1 × 104 ćelija/jažici) su kultivirane na staklenim pločicama u odgovarajućim pločama za kulturu sa staklenim dnom (Ibidi GmbH, Martinsried, Njemačka). Nakon 24 sata, žive LX-2 ćelije su inkubirane sa 100 μM MTR tokom 20 minuta na 37 °C, a ćelijska jezgra su obojena sa DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) kao što je prethodno opisano [29]. Mitohondrijalne mreže su vizualizirane korištenjem inverznog mikroskopa Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Njemačka) opremljenog konfokalnim modulom Zeiss LSM 800 na 37 °C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2 koristeći objektiv 63×NA 1.3. Dobili smo deset slika Z-serije za svaki tip uzorka. Svaka Z-serija sadrži 30 sekcija, svaka debljine 9,86 μm. Za svaki uzorak, slike deset različitih vidnih polja su dobijene korištenjem ZEN 2009 softvera (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Njemačka), a analiza mitohondrijske morfologije je izvršena korištenjem ImageJ softvera (v1.54d) [30, 31] prema parametrima detaljno opisanim u Dodatnim metodama 3.
Ćelije su fiksirane sa 2% glutaraldehida u 0,1 M fosfatnom puferu, nakon čega je uslijedila fiksacija sa 1% rastvorom osmijum tetroksida (Sigma Aldrich, MO, SAD), postepeno dehidrirane acetonom (Merck, Darmstadt, Njemačka) i na kraju ugrađene u epoksidnu smolu. Pripremljeni su ultratanki rezovi i obojeni sa 1% uranil acetata (Merck, Darmstadt, Njemačka) i 1% olovnog citrata (Merck, Darmstadt, Njemačka). Ultrastrukturne slike su dobijene korištenjem transmisionog elektronskog mikroskopa JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokio, Japan) pri ubrzavajućem naponu od 80 kV.
Morfologija LX-2 ćelija tretiranih IPA tokom 24 sata analizirana je fazno-kontrastnom mikroskopijom pri uvećanju od 50x korištenjem Zeiss inverznog svjetlosnog mikroskopa (Zeiss Axio Vert.A1 i AxioCam MRm, Jena, Njemačka).
Klinički podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija ili medijana (interkvartilni raspon: IQR). Za poređenje razlika između tri studijske grupe korištena je jednosmjerna analiza varijanse (kontinuirane varijable) ili χ² test (kategoričke varijable). Stopa lažno pozitivnih rezultata (FDR) korištena je za korekciju višestrukog testiranja, a geni sa FDR < 0,05 smatrani su statistički značajnim. Spearmanova korelacijska analiza korištena je za korelaciju metilacije CpG DNK s intenzitetom IPA signala, pri čemu su prijavljene nominalne p vrijednosti (p < 0,05).
Analiza genskog puta provedena je korištenjem web-baziranog alata za analizu genskog skupa (WebGestalt) za 268 transkripata (nominalni p < 0,01), 119 transkripata povezanih s mitohondrijama (nominalni p < 0,05) i 4350 CpG od 3093 transkripata jetre koji su bili povezani s nivoima IPA u cirkulaciji u serumu. Slobodno dostupan alat Venny DB (verzija 2.1.0) korišten je za pronalaženje preklapajućih gena, a StringDB (verzija 11.5) korišten je za vizualizaciju interakcija protein-protein.
Za LX-2 eksperiment, uzorci su testirani na normalnost korištenjem D'Agostino-Pearsonovog testa. Podaci su dobiveni iz najmanje tri biološka ponavljanja i podvrgnuti jednosmjernoj ANOVA s Bonferroni post hoc testom. P-vrijednost manja od 0,05 smatrana je statistički značajnom. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD, a broj eksperimenata je naznačen na svakoj slici. Sve analize i grafikoni su provedeni korištenjem statističkog softvera GraphPad Prism 8 za Windows (GraphPad Software Inc., verzija 8.4.3, San Diego, SAD).
Prvo smo istražili povezanost nivoa IPA u serumu s transkriptima jetre, cijelog tijela i mitohondrijima. U ukupnom profilu transkripata, najjači gen povezan s nivoima IPA u serumu bio je MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; protein kinaza aktivirana mitogenom 3); u profilu transkripata povezanom s mitohondrijama, najjači povezani gen bio je AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serin/treonin kinaza 1) (Dodatna datoteka 1 i Dodatna datoteka 2).
Zatim smo analizirali globalne transkripte (n = 268; p < 0,01) i transkripte povezane s mitohondrijama (n = 119; p < 0,05), te smo na kraju identificirali apoptozu kao najznačajniji kanonski put (p = 0,0089). Za mitohondrijske transkripte povezane s nivoima IPA u serumu, fokusirali smo se na apoptozu (FDR = 0,00001), mitofagiju (FDR = 0,00029) i TNF signalne puteve (FDR = 0,000006) (Slika 1A, Tabela 2 i Dodatne slike 1A-B).
Analiza preklapanja globalnih, mitohondrijima povezanih transkripata i metilacije DNK u ljudskoj jetri u povezanosti sa nivoima IPA u serumu. A predstavlja 268 globalnih transkripata, 119 mitohondrijima povezanih transkripata i metilirane DNK transkripata koji su mapirani na 3092 CpG mjesta povezana sa nivoima IPA u serumu (p vrijednosti ​​< 0,01 za globalne transkripte i metiliranu DNK, i p vrijednosti ​​< 0,05 za mitohondrijalne transkripte). Glavni preklapajući transkripti prikazani su u sredini (AKT1 i YKT6). B Interakcijska mapa 13 gena sa najvišim rezultatom interakcije (0,900) sa drugim genima konstruirana je od 56 preklapajućih gena (regija crne linije) koji su bili značajno povezani sa nivoima IPA u serumu korištenjem online alata StringDB. Zelena: Geni mapirani na ćelijsku komponentu Gene Ontology (GO): mitohondrije (GO:0005739). AKT1 je protein s najvišim rezultatom (0,900) za interakcije s drugim proteinima na osnovu podataka (na osnovu analize teksta, eksperimenata, baza podataka i koekspresije). Čvorovi mreže predstavljaju proteine, a rubovi predstavljaju veze između proteina.
Budući da metaboliti crijevne mikrobiote mogu regulirati epigenetički sastav putem metilacije DNK [32], istražili smo da li su nivoi IPA u serumu povezani s metilacijom DNK u jetri. Otkrili smo da su dva glavna mjesta metilacije povezana s nivoima IPA u serumu blizu regije 3 bogate prolin-serinom (C19orf55) i člana 6 porodice proteina toplotnog šoka B (mali) (HSPB6) (Dodatna datoteka 3). Metilacija DNK 4350 CpG (p < 0,01) bila je u korelaciji s nivoima IPA u serumu i obogaćena je regulatornim putevima dugovječnosti (p = 0,006) (Slika 1A, Tabela 2 i Dodatna slika 1C).
Da bismo razumjeli biološke mehanizme koji leže u osnovi povezanosti između nivoa IPA u serumu, globalnih transkripata, transkripata povezanih s mitohondrijama i metilacije DNK u ljudskoj jetri, izvršili smo analizu preklapanja gena identificiranih u prethodnoj analizi puta (Slika 1A). Rezultati analize obogaćivanja puta 56 preklapajućih gena (unutar crne linije na Slici 1A) pokazali su da je put apoptoze (p = 0,00029) istaknuo dva gena zajednička za tri analize: AKT1 i YKT6 (homolog YKT6 v-SNARE), kao što je prikazano na Vennovom dijagramu (Dopunska slika 2 i Slika 1A). Zanimljivo je da smo otkrili da su AKT1 (cg19831386) i YKT6 (cg24161647) pozitivno korelirali s nivoima IPA u serumu (Dodatna datoteka 3). Da bismo identificirali potencijalne interakcije proteina između genskih produkata, odabrali smo 13 gena s najvišim rezultatom zajedničke regije (0,900) među 56 preklapajućih gena kao ulaz i konstruirali mapu interakcija. Prema nivou pouzdanosti (marginalna pouzdanost), gen AKT1 sa najvišim rezultatom (0,900) bio je na vrhu (Slika 1B).
Na osnovu analize puta, otkrili smo da je apoptoza glavni put, pa smo istražili da li bi tretman IPA uticao na apoptozu HSC-a in vitro. Prethodno smo pokazali da različite doze IPA (10 μM, 100 μM i 1 mM) nisu toksične za LX-2 ćelije [15]. Ova studija je pokazala da tretman IPA sa 10 μM i 100 μM povećava broj održivih i nekrotičnih ćelija. Međutim, u poređenju sa kontrolnom grupom, održivost ćelija se smanjila pri koncentraciji IPA od 1 mM, dok je stopa nekroze ćelija ostala nepromijenjena (Slika 2A, B). Zatim, kako bismo pronašli optimalnu koncentraciju za indukciju apoptoze u LX-2 ćelijama, testirali smo 10 μM, 100 μM i 1 mM IPA tokom 24 sata (Slika 2A-E i Dopunska slika 3A-B). Zanimljivo je da su IPA od 10 μM i 100 μM smanjili stopu apoptoze (%), međutim, IPA od 1 mM povećao je kasnu apoptozu i stopu apoptoze (%) u poređenju s kontrolom te je stoga odabran za daljnje eksperimente (Slike 2A–D).
IPA indukuje apoptozu LX-2 ćelija. Metoda dvostrukog bojenja s Aneksinom V i 7-AAD korištena je za kvantifikaciju stope apoptoze i morfologije ćelija protočnom citometrijom. BA ćelije su inkubirane sa 10 μM, 100 μM i 1 mM IPA tokom 24 sata ili sa F-H TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM IPA u medijumu bez seruma tokom 24 sata. A: žive ćelije (Aneksin V -/ 7AAD-); B: nekrotične ćelije (Aneksin V -/ 7AAD+); C, F: rane (Aneksin V +/ 7AAD-); D, G: kasne (Aneksin V+/7AAD.+); E, H: procenat ukupnih ranih i kasnih apoptotičkih ćelija u stopi apoptoze (%). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD, n = 3 nezavisna eksperimenta. Statistička poređenja su izvršena korištenjem jednosmjerne ANOVA s Bonferroni post hoc testom. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Kao što smo prethodno pokazali, 5 ng/ml TGF-β1 može inducirati aktivaciju HSC povećanjem ekspresije klasičnih marker gena [15]. LX-2 ćelije su tretirane sa 5 ng/ml TGF-β1 i 1 mM IPA u kombinaciji (Slika 2E–H). Tretman TGF-β1 nije promijenio stopu apoptoze, međutim, istovremeni tretman IPA povećao je kasnu apoptozu i stopu apoptoze (%) u poređenju sa tretmanom TGF-β1 (Slika 2E–H). Ovi rezultati ukazuju da 1 mM IPA može promovirati apoptozu u LX-2 ćelijama nezavisno od indukcije TGF-β1.
Dalje smo istražili uticaj IPA na mitohondrijalno disanje u LX-2 ćelijama. Rezultati su pokazali da je 1 mM IPA smanjio parametre potrošnje kiseonika (OCR): nemitohondrijalno disanje, bazalno i maksimalno disanje, curenje protona i proizvodnju ATP-a u poređenju sa kontrolnom grupom (Slika 3A, B), dok se indeks bioenergetskog zdravlja (BHI) nije promijenio.
IPA smanjuje mitohondrijalno disanje u LX-2 ćelijama. Kriva mitohondrijalne respiracije (OCR) predstavljena je kao parametri mitohondrijalne respiracije (nemitohondrijalna respiracija, bazalna respiracija, maksimalno disanje, curenje protona, stvaranje ATP-a, SRC i BHI). Ćelije A i B inkubirane su sa 10 μM, 100 μM i 1 mM IPA tokom 24 sata, respektivno. Ćelije C i D inkubirane su sa TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM IPA u mediju bez seruma tokom 24 sata, respektivno. Sva mjerenja su normalizovana na sadržaj DNK korištenjem CyQuant kita. BHI: indeks bioenergetskog zdravlja; SRC: respiratorni rezervni kapacitet; OCR: brzina potrošnje kiseonika. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD), n = 5 nezavisnih eksperimenata. Statistička poređenja su izvršena korištenjem jednosmjerne ANOVA i Bonferroni post hoc testa. *p < 0,05; **p < 0,01; i ***p < 0,001
Kako bismo stekli sveobuhvatnije razumijevanje utjecaja IPA na bioenergetski profil LX-2 ćelija aktiviranih TGF-β1, analizirali smo mitohondrijalnu oksidativnu fosforilaciju pomoću OCR-a (Sl. 3C,D). Rezultati su pokazali da tretman TGF-β1 može smanjiti maksimalno disanje, respiratorni rezervni kapacitet (SRC) i BHI u poređenju s kontrolnom grupom (Sl. 3C,D). Osim toga, kombinirani tretman smanjio je bazalno disanje, curenje protona i proizvodnju ATP-a, ali su SRC i BHI bili značajno viši od onih tretiranih TGF-β1 (Sl. 3C,D).
Također smo proveli "Test fenotipa ćelijske energije" koji je obezbijedio Seahorse softver (Dopunska slika 4A-D). Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 3B, metabolički potencijali i OCR i ECAR su smanjeni nakon tretmana TGF-β1, međutim, nije uočena razlika u grupama kombinovanog i IPA tretmana u poređenju sa kontrolnom grupom. Nadalje, i bazalni i nivoi stresa OCR su smanjeni nakon kombinovanog i IPA tretmana u poređenju sa kontrolnom grupom (Dopunska slika 4C). Zanimljivo je da je sličan obrazac uočen i sa kombinovanom terapijom, gdje nije uočena promjena u bazalnim i nivoima stresa ECAR u poređenju sa tretmanom TGF-β1 (Dopunska slika 4C). U HSC-ima, smanjenje mitohondrijske oksidativne fosforilacije i sposobnost kombinovanog tretmana da obnovi SCR i BHI nakon izlaganja tretmanu TGF-β1 nisu promijenili metabolički potencijal (OCR i ECAR). Uzeti zajedno, ovi rezultati ukazuju na to da IPA može smanjiti bioenergetiku u HSC-ima, što sugeriše da IPA može izazvati niži energetski profil koji pomiče HSC fenotip prema inaktivaciji (Dopunska slika 4D).
Učinak IPA na dinamiku mitohondrija istražen je korištenjem trodimenzionalne kvantifikacije morfologije mitohondrija i mrežnih veza, kao i MTR bojenja (Slika 4 i Dopunska slika 5). Slika 4 pokazuje da je, u poređenju s kontrolnom grupom, tretman TGF-β1 smanjio srednju površinu, broj grana, ukupnu dužinu grana i broj spojeva grana (Slika 4A i B) te promijenio udio mitohondrija od sferne do intermedijarne morfologije (Slika 4C). Samo tretman IPA smanjio je prosječni volumen mitohondrija i promijenio udio mitohondrija od sferne do intermedijarne morfologije u poređenju s kontrolnom grupom (Slika 4A). Nasuprot tome, sferičnost, srednja dužina grana i aktivnost mitohondrija procijenjena MTR-om zavisnim od potencijala mitohondrijalne membrane (Slika 4A i E) ostali su nepromijenjeni i ovi parametri se nisu razlikovali između grupa. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da tretman TGF-β1 i IPA moduliraju oblik i veličinu mitohondrija, kao i složenost mreže u živim LX-2 ćelijama.
IPA mijenja mitohondrijalnu dinamiku i količinu mitohondrijalne DNK u LX-2 ćelijama. A. Reprezentativne konfokalne slike živih LX-2 ćelija inkubiranih sa TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM IPA tokom 24 sata u medijumu bez seruma, koje prikazuju mitohondrijalne mreže obojene sa Mitotracker™ Red CMXRos i jezgra obojena plavo sa DAPI. Svi podaci sadržavali su najmanje 15 slika po grupi. Dobili smo 10 Z-stack slika za svaku vrstu uzorka. Svaka sekvenca Z-ose sadržavala je 30 slojeva, svaki debljine 9,86 μm. Mjerna traka: 10 μm. B. Reprezentativni objekti (samo mitohondrije) identifikovani primjenom adaptivnog određivanja praga na sliku. Kvantitativna analiza i poređenje veza mitohondrijalne morfološke mreže izvršene su za sve ćelije u svakoj grupi. C. Učestalost odnosa oblika mitohondrija. Vrijednosti blizu 0 označavaju sferne oblike, a vrijednosti blizu 1 označavaju filamentne oblike. D Sadržaj mitohondrijalne DNK (mtDNK) određen je kao što je opisano u Materijalima i metodama. Analiza E Mitotracker™ Red CMXRos provedena je protočnom citometrijom (30.000 događaja) kao što je opisano u odjeljku Materijali i metode. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD, n = 3 nezavisna eksperimenta. Statističke usporedbe provedene su korištenjem jednosmjerne ANOVA i Bonferroni post hoc testa. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Zatim smo analizirali sadržaj mtDNK u LX-2 ćelijama kao indikator broja mitohondrija. U poređenju sa kontrolnom grupom, sadržaj mtDNK je bio povećan u grupi tretiranoj TGF-β1 (Slika 4D). U poređenju sa grupom tretiranom TGF-β1, sadržaj mtDNK je bio smanjen u grupi kombinovanog tretmana (Slika 4D), što ukazuje na to da IPA može smanjiti sadržaj mtDNK i moguće broj mitohondrija, kao i mitohondrijalno disanje (Slika 3C). Štaviše, čini se da IPA smanjuje sadržaj mtDNK u kombinovanom tretmanu, ali nije uticala na mitohondrijalnu aktivnost posredovanu MTR-om (Slike 4A-C).
Istražili smo povezanost IPA s nivoima mRNA gena povezanih s fibrozom, apoptozom, preživljavanjem i mitohondrijalnom dinamikom u LX-2 ćelijama (Slika 5A–D). U poređenju s kontrolnom grupom, grupa tretirana TGF-β1 pokazala je povećanu ekspresiju gena kao što su kolagen tipa I α2 lanac (COL1A2), α-glatki mišićni aktin (αSMA), matriksna metaloproteinaza 2 (MMP2), tkivni inhibitor metaloproteinaze 1 (TIMP1) i gen sličan dinaminu 1 (DRP1), što ukazuje na povećanu fibrozu i aktivaciju. Nadalje, u poređenju s kontrolnom grupom, tretman TGF-β1 smanjio je nivoe mRNA nuklearnog pregnan X receptora (PXR), kaspaze 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitora B-ćelijskog α, pojačivača svjetlosnog peptida gena nuklearnog faktora κ (NFκB1A) i inhibitora podjedinice kinaze nuklearnog faktora κB β (IKBKB) (Slika 5A–D). U poređenju sa tretmanom TGF-β1, kombinovani tretman sa TGF-β1 i IPA smanjio je ekspresiju COL1A2 i MMP2, ali je povećao nivoe mRNA PXR, TIMP1, B-ćelijskog limfoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β i IKBKB. Tretman IPA značajno je smanjio ekspresiju MMP2, proteina X povezanog sa Bcl-2 (BAX), AKT1, proteina optičke atrofije 1 (OPA1) i mitohondrijskog fuzijskog proteina 2 (MFN2), dok je ekspresija CASP8, NFκB1A, NFκB1B i IKBKB bila povećana u poređenju sa kontrolnom grupom. Međutim, nije pronađena razlika u ekspresiji kaspaze-3 (CASP3), faktora aktiviranja apoptotičke peptidaze 1 (APAF1), mitohondrijskog fuzijskog proteina 1 (MFN1) i fisijskog proteina 1 (FIS1). Zajedno, ovi rezultati ukazuju na to da tretman IPA modulira ekspresiju gena povezanih s fibrozom, apoptozom, preživljavanjem i mitohondrijalnom dinamikom. Naši podaci ukazuju na to da tretman IPA smanjuje fibrozu u LX-2 ćelijama; istovremeno, stimulira preživljavanje pomicanjem fenotipa prema inaktivaciji.
IPA modulira ekspresiju fibroblasta, apoptotičkih, vijabilnih i gena mitohondrijalne dinamike u LX-2 ćelijama. Histogrami prikazuju ekspresiju mRNA u odnosu na endogenu kontrolu (RPLP0 ili PPIA) nakon što su LX-2 ćelije indukovane sa TGF-β1 i IPA u medijumu bez seruma tokom 24 sata. A označava fibroblaste, B označava apoptotičke ćelije, C označava preživjele ćelije, a D označava ekspresiju gena mitohondrijalne dinamike. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD), n = 3 nezavisna eksperimenta. Statističke usporedbe su izvršene korištenjem jednosmjerne ANOVA i Bonferroni post hoc testa. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Zatim su promjene u veličini ćelija (FSC-H) i citoplazmatskoj složenosti (SSC-H) procijenjene protočnom citometrijom (Slika 6A,B), a promjene u morfologiji ćelija nakon tretmana IPA procijenjene su transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM) i faznokontrastnom mikroskopijom (Dopunska slika 6A-B). Kao što se i očekivalo, ćelije u grupi tretiranoj TGF-β1 su se povećale u veličini u poređenju sa kontrolnom grupom (Slika 6A,B), pokazujući klasičnu ekspanziju hrapavog endoplazmatskog retikuluma (ER*) i fagolizosoma (P), što ukazuje na aktivaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSC) (Dopunska slika 6A). Međutim, u poređenju sa grupom tretiranom TGF-β1, veličina ćelija, citoplazmatska složenost (Slika 6A,B) i sadržaj ER* su smanjeni u grupi tretiranoj kombinovanim tretmanom TGF-β1 i IPA (Dopunska slika 6A). Nadalje, tretman IPA je smanjio veličinu ćelija, citoplazmatsku složenost (Slike 6A,B), sadržaj P i ER* (Dopunska slika 6A) u poređenju sa kontrolnom grupom. Osim toga, sadržaj apoptotičkih ćelija se povećao nakon 24 sata tretmana IPA u poređenju sa kontrolnom grupom (bijele strelice, Dodatna slika 6B). Zajedno, ovi rezultati ukazuju na to da 1 mM IPA može stimulisati apoptozu HSC i preokrenuti promjene u morfološkim parametrima ćelija izazvane TGF-β1, čime se reguliše veličina i složenost ćelija, što može biti povezano sa inaktivacijom HSC.
IPA mijenja veličinu ćelija i citoplazmatsku složenost u LX-2 ćelijama. Reprezentativne slike protočne citometrijske analize. Analiza je koristila strategiju zatvaranja specifičnu za LX-2 ćelije: SSC-A/FSC-A za definiranje ćelijske populacije, FSC-H/FSC-A za identifikaciju dubleta i SSC-H/FSC-H za analizu veličine i složenosti ćelija. Ćelije su inkubirane sa TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM IPA u mediju bez seruma tokom 24 sata. LX-2 ćelije su raspoređene u donji lijevi kvadrant (SSC-H-/FSC-H-), gornji lijevi kvadrant (SSC-H+/FSC-H-), donji desni kvadrant (SSC-H-/FSC-H+) i gornji desni kvadrant (SSC-H+/FSC-H+) za analizu veličine ćelija i citoplazmatske složenosti. B. Morfologija ćelija analizirana je protočnom citometrijom korištenjem FSC-H (direktno raspršenje, veličina ćelije) i SSC-H (bočno raspršenje, citoplazmatska složenost) (30.000 događaja). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD, n = 3 nezavisna eksperimenta. Statističke usporedbe su provedene korištenjem jednosmjerne ANOVA i Bonferroni post hoc testa. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 i ****p < 0,0001
Metaboliti u crijevima, poput IPA, postali su vruća tema istraživanja, što sugerira da bi se novi ciljevi mogli otkriti u crijevnoj mikrobioti. Stoga je zanimljivo da se IPA, metabolit koji smo povezali s fibrozom jetre kod ljudi [15], pokazao kao potencijalni antifibrotički spoj u životinjskim modelima [13, 14]. Ovdje prvi put demonstriramo povezanost između serumskog IPA i globalnih transkriptomskih svojstava jetre te metilacije DNK kod gojaznih osoba bez dijabetesa tipa 2 (T2D), ističući apoptozu, mitofagiju i dugovječnost, kao i mogući kandidatski gen AKT1 koji regulira homeostazu jetre. Još jedna novost naše studije je da smo pokazali interakciju tretmana IPA s apoptozom, morfologijom ćelija, mitohondrijalnom bioenergetikom i dinamikom u LX-2 ćelijama, što ukazuje na niži energetski spektar koji pomiče HSC fenotip prema inaktivaciji, čineći IPA potencijalnim kandidatom za poboljšanje fibroze jetre.
Otkrili smo da su apoptoza, mitofagija i dugovječnost najvažniji kanonski putevi obogaćeni genima jetre povezanim s cirkulirajućim serumskim IPA. Poremećaj sistema kontrole kvalitete mitohondrija (MQC) može dovesti do mitohondrijalne disfunkcije, mitofagije i apoptoze, čime se potiče pojava MASLD-a [33, 34]. Stoga možemo nagađati da IPA može biti uključen u održavanje dinamike ćelija i integriteta mitohondrija putem apoptoze, mitofagije i dugovječnosti u jetri. Naši podaci su pokazali da su dva gena bila zajednička u tri testa: YKT6 i AKT1. Vrijedi napomenuti da je YKT6 SNARE protein uključen u proces fuzije ćelijske membrane. Igra ulogu u autofagiji i mitofagiji formiranjem inicijacionog kompleksa sa STX17 i SNAP29 na autofagosomu, čime se potiče fuzija autofagosoma i lizosoma [35]. Nadalje, gubitak funkcije YKT6 rezultira oštećenom mitofagijom [36], dok je pojačana regulacija YKT6 povezana s progresijom hepatocelularnog karcinoma (HCC), pokazujući povećano preživljavanje ćelija [37]. S druge strane, AKT1 je najvažniji gen koji interaguje i igra važnu ulogu u bolestima jetre, uključujući PI3K/AKT signalni put, ćelijski ciklus, migraciju ćelija, proliferaciju, fokalnu adheziju, mitohondrijalnu funkciju i lučenje kolagena [38–40]. Aktivirani PI3K/AKT signalni put može aktivirati hematopoetske matične ćelije (HSC), koje su ćelije odgovorne za proizvodnju ekstracelularnog matriksa (ECM), a njegova disregulacija može doprinijeti pojavi i progresiji fibroze jetre [40]. Osim toga, AKT je jedan od ključnih faktora preživljavanja ćelija koji inhibira p53-zavisnu apoptozu ćelija, a aktivacija AKT može biti povezana s inhibicijom apoptoze ćelija jetre [41, 42]. Dobijeni rezultati sugeriraju da IPA može biti uključen u apoptozu povezanu s mitohondrijama jetre utičući na odluku hepatocita o ulasku u apoptozu ili preživljavanju. Ove efekte mogu regulisati AKT i/ili YKT6 kandidatski geni, koji su ključni za homeostazu jetre.
Naši rezultati su pokazali da je 1 mM IPA indukovao apoptozu i smanjio mitohondrijalno disanje u LX-2 ćelijama nezavisno od tretmana TGF-β1. Važno je napomenuti da je apoptoza glavni put za rješavanje fibroze i aktivaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSC), te je također ključni događaj u reverzibilnom fiziološkom odgovoru na fibrozu jetre [4, 43]. Štaviše, obnova BHI u LX-2 ćelijama nakon kombinovanog tretmana pružila je nove uvide u potencijalnu ulogu IPA u regulaciji mitohondrijalne bioenergetike. U uslovima mirovanja i neaktivnosti, hematopoetske ćelije normalno koriste mitohondrijalnu oksidativnu fosforilaciju za proizvodnju ATP-a i imaju nisku metaboličku aktivnost. S druge strane, aktivacija HSC pojačava mitohondrijalno disanje i biosintezu kako bi kompenzovala energetske potrebe ulaska u glikolitičko stanje [44]. Činjenica da IPA nije uticala na metabolički potencijal i ECAR sugeriše da je glikolitički put manje prioritetan. Slično tome, druga studija je pokazala da je 1 mM IPA bio u stanju da modulira aktivnost mitohondrijalnog respiratornog lanca u kardiomiocitima, ćelijskoj liniji ljudskih hepatocita (Huh7) i endotelnim ćelijama ljudske pupčane vene (HUVEC); Međutim, nije pronađen učinak IPA na glikolizu u kardiomiocitima, što ukazuje na to da IPA može utjecati na bioenergetiku drugih tipova ćelija [45]. Stoga pretpostavljamo da 1 mM IPA može djelovati kao blagi hemijski razdvajač, budući da može značajno smanjiti ekspresiju fibrogenih gena, morfologiju ćelija i mitohondrijalnu bioenergetiku bez promjene količine mtDNK [46]. Mitohondrijalni razdvajači mogu inhibirati fibrozu induciranu kulturom i aktivaciju HSC [47] te smanjiti proizvodnju mitohondrijalnog ATP-a reguliranu ili induciranu određenim proteinima kao što su proteini za razdvajanje (UCP) ili adenin nukleotid translokaza (ANT). Ovisno o tipu ćelije, ovaj fenomen može zaštititi ćelije od apoptoze i/ili promovirati apoptozu [46]. Međutim, potrebna su daljnja istraživanja kako bi se razjasnila uloga IPA kao mitohondrijalnog razdvajača u inaktivaciji hematopoetskih matičnih ćelija.
Zatim smo istražili da li se promjene u mitohondrijalnom disanju odražavaju na mitohondrijalnu morfologiju u živim LX-2 ćelijama. Zanimljivo je da tretman TGF-β1 mijenja mitohondrijalnu proporciju od sferne do srednjeg oblika, sa smanjenim mitohondrijalnim grananjem i povećanom ekspresijom DRP1, ključnog faktora u mitohondrijskoj fisiji [48]. Nadalje, fragmentacija mitohondrija povezana je s ukupnom složenošću mreže, a prelazak od fuzije do fisije je ključan za aktivaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSC), dok inhibicija mitohondrijalne fisije dovodi do apoptoze HSC [49]. Dakle, naši rezultati ukazuju na to da tretman TGF-β1 može izazvati smanjenje složenosti mitohondrijalne mreže sa smanjenim grananjem, što je češće kod mitohondrijalne fisije povezane s aktiviranim hematopoetskim matičnim ćelijama (HSC). Nadalje, naši podaci su pokazali da IPA može promijeniti proporciju mitohondrija od sferne do srednjeg oblika, čime se smanjuje ekspresija OPA1 i MFN2. Studije su pokazale da smanjenje OPA1 može uzrokovati smanjenje potencijala mitohondrijalne membrane i pokrenuti apoptozu ćelija [50]. Poznato je da MFN2 posreduje u mitohondrijskoj fuziji i apoptozi [51]. Dobijeni rezultati ukazuju na to da indukcija LX-2 ćelija pomoću TGF-β1 i/ili IPA modulira oblik i veličinu mitohondrija, kao i stanje aktivacije i složenost mreže.
Naši rezultati ukazuju na to da kombinovani tretman TGFβ-1 i IPA može smanjiti mtDNK i morfološke parametre ćelija regulisanjem ekspresije mRNA gena fibroze, apoptoze i gena povezanih s preživljavanjem u ćelijama koje izbjegavaju apoptozu. Zaista, IPA je smanjio nivo ekspresije mRNA AKT1 i važnih gena fibroze kao što su COL1A2 i MMP2, ali je povećao nivo ekspresije CASP8, koji je povezan s apoptozom. Naši rezultati su pokazali da se nakon tretmana IPA, ekspresija BAX smanjila, a ekspresija mRNA podjedinica porodice TIMP1, BCL-2 i NF-κB povećala, što ukazuje na to da IPA može stimulisati signale preživljavanja u hematopoetskim matičnim ćelijama (HSC) koje izbjegavaju apoptozu. Ove molekule mogu djelovati kao signali za preživljavanje u aktiviranim hematopoetskim matičnim ćelijama, što može biti povezano sa povećanom ekspresijom anti-apoptotičkih proteina (kao što je Bcl-2), smanjenom ekspresijom pro-apoptotičkog BAX-a i složenom interakcijom između TIMP-a i NF-κB [5, 7]. IPA ostvaruje svoje efekte putem PXR-a, a otkrili smo da kombinovani tretman sa TGF-β1 i IPA povećava nivoe ekspresije PXR mRNA, što ukazuje na supresiju aktivacije HSC-a. Poznato je da aktivirana PXR signalizacija inhibira aktivaciju HSC-a i in vivo i in vitro [52, 53]. Naši rezultati ukazuju na to da IPA može učestvovati u uklanjanju aktiviranih HSC-a promovisanjem apoptoze, smanjenjem fibroze i metabolizma mitohondrija, te pojačavanjem signala preživljavanja, što su tipični procesi koji pretvaraju aktivirani HSC fenotip u inaktivirani. Drugo moguće objašnjenje za potencijalni mehanizam i ulogu IPA u apoptozi je da on uklanja disfunkcionalne mitohondrije prvenstveno putem mitofagije (intrinzični put) i ekstrinzičnog TNF signalnog puta (Tabela 1), koji je direktno povezan sa NF-κB signalnim putem preživljavanja (Dodatna slika 7). Zanimljivo je da su geni obogaćeni IPA-om sposobni indukovati pro-apoptotičke i pro-preživljavajuće signale u apoptotičkom putu [54], što sugeriše da IPA može indukovati apoptotički put ili preživljavanje interakcijom sa ovim genima. Međutim, kako IPA indukuje apoptozu ili preživljavanje tokom aktivacije HSC-a i njeni mehanički putevi ostaju nejasni.
IPA je mikrobni metabolit koji se formira iz triptofana iz hrane putem crijevne mikrobiote. Studije su pokazale da ima protuupalna, antioksidativna i epigenetička regulatorna svojstva u crijevnom okruženju.[55] Studije su pokazale da IPA može modulirati funkciju crijevne barijere i smanjiti oksidativni stres, što može doprinijeti njegovim lokalnim fiziološkim efektima.[56] U stvari, IPA se transportuje do ciljnih organa putem cirkulacije, a budući da IPA dijeli sličnu strukturu glavnog metabolita s derivatima triptofana, serotonina i indola, IPA vrši metaboličke akcije što rezultira kompetitivnom metaboličkom sudbinom.[52] IPA se može takmičiti s metabolitima izvedenim iz triptofana za mjesta vezivanja na enzimima ili receptorima, potencijalno remeteći normalne metaboličke puteve. Ovo naglašava potrebu za daljnjim istraživanjima njegove farmakokinetike i farmakodinamike kako bi se bolje razumio njegov terapijski prozor.[57] Ostaje da se vidi da li se to može dogoditi i u hematopoetskim matičnim ćelijama (HSC).
Priznajemo da naša studija ima neka ograničenja. Kako bismo specifično ispitali povezanosti povezane s IPA, isključili smo pacijente s dijabetesom melitusom tipa 2 (T2DM). Priznajemo da to ograničava široku primjenjivost naših nalaza na pacijente s dijabetesom melitusom tipa 2 i uznapredovalom bolešću jetre. Iako je fiziološka koncentracija IPA u ljudskom serumu 1-10 μM [11, 20], koncentracija od 1 mM IPA odabrana je na osnovu najviše netoksične koncentracije [15] i najveće stope apoptoze, bez razlike u procentu populacije nekrotičnih ćelija. Iako su u ovoj studiji korišteni suprafiziološki nivoi IPA, trenutno ne postoji konsenzus u vezi s efektivnom dozom IPA [52]. Iako su naši rezultati značajni, šira metabolička sudbina IPA ostaje aktivno područje istraživanja. Štaviše, naši nalazi o povezanosti između nivoa IPA u serumu i metilacije DNK transkripata jetre dobijeni su ne samo iz hematopoetskih matičnih ćelija (HSC) već i iz tkiva jetre. Odlučili smo se za korištenje ljudskih LX-2 ćelija na osnovu naših prethodnih nalaza iz analize transkriptoma da je IPA povezana s aktivacijom hematopoetskih matičnih ćelija (HSC) [15], a HSC su glavne ćelije uključene u progresiju fibroze jetre. Jetra se sastoji od više tipova ćelija, tako da bi se trebali razmotriti i drugi modeli ćelija, kao što je sistem ko-kulture hepatocita-HSC-imunih ćelija u kombinaciji s aktivacijom kaspaze i fragmentacijom DNK, kao i mehanizam djelovanja, uključujući nivo proteina, kako bi se proučila uloga IPA i njena interakcija s drugim tipovima ćelija jetre.