Različite teorije odbrane biljaka pružaju važne teorijske smjernice za objašnjenje obrazaca metabolizma specijaliziranog za biljke, ali njihova ključna predviđanja tek trebaju biti testirana. Ovdje smo koristili nepristrasnu tandemsku analizu masene spektrometrije (MS/MS) kako bismo sistematski istražili metabolom atenuiranih sojeva duhana od pojedinačnih biljaka do populacija i blisko srodnih vrsta, te obradili veliki broj teorija karakteristika masene spektrometrije zasnovanih na složenim spektrima u informacijama. Okvir za testiranje ključnih predviđanja teorija optimalne odbrane (OD) i pokretnih ciljeva (MT). Informacijska komponenta metabolomike biljaka je u skladu s OD teorijom, ali je u suprotnosti s glavnim predviđanjem MT teorije o dinamici metabolomike uzrokovanoj biljojedima. Od mikro do makro evolucijske skale, signal jasmonata je identificiran kao glavna odrednica OD, dok je signal etilena omogućio fino podešavanje odgovora specifičnog za biljojede, što je označeno MS/MS molekularnom mrežom.
Specijalni metaboliti s različitim strukturama glavni su učesnici u prilagođavanju biljaka okolini, posebno u odbrani od neprijatelja (1). Nevjerovatna raznolikost specijalnog metabolizma koji se nalazi u biljkama stimulirala je decenije dubinskih istraživanja njegovih mnogih aspekata ekoloških funkcija i formirala dugu listu teorija odbrane biljaka, koje predstavljaju evolucijski i ekološki razvoj interakcija biljaka i insekata. Empirijska istraživanja pružaju važne smjernice (2). Međutim, ove teorije odbrane biljaka nisu slijedile normativni put hipotetičkog deduktivnog zaključivanja, u kojem su ključna predviđanja bila na istom nivou analize (3) i eksperimentalno su testirana kako bi se unaprijedio sljedeći ciklus teorijskog razvoja (4). Tehnička ograničenja ograničavaju prikupljanje podataka na specifične metaboličke kategorije i isključuju sveobuhvatnu analizu specijaliziranih metabolita, čime se sprječavaju međukategorijska poređenja koja su neophodna za teorijski razvoj (5). Nedostatak sveobuhvatnih metabolomskih podataka i zajedničke valute za poređenje toka obrade metaboličkog prostora između različitih biljnih grupa ometa naučnu zrelost ove oblasti.
Najnoviji razvoj u oblasti metabolomike tandemske masene spektrometrije (MS/MS) može sveobuhvatno okarakterizirati metaboličke promjene unutar i između vrsta datog sistemskog klada, te se može kombinirati s računarskim metodama za izračunavanje strukturne sličnosti između ovih složenih smjesa. Prethodno znanje hemije (5). Kombinacija naprednih tehnologija u analizi i računarstvu pruža neophodan okvir za dugoročno testiranje mnogih predviđanja ekoloških i evolucijskih teorija metaboličke raznolikosti. Shannon (6) je prvi put uveo teoriju informacija u svom ključnom članku 1948. godine, postavljajući temelje za matematičku analizu informacija, koja je korištena u mnogim oblastima osim u svojoj prvobitnoj primjeni. U genomici, teorija informacija je uspješno primijenjena za kvantificiranje konzervativnih informacija o sekvencama (7). U istraživanjima transkriptomike, teorija informacija analizira ukupne promjene u transkriptomu (8). U prethodnim istraživanjima primijenili smo statistički okvir teorije informacija na metabolomiku kako bismo opisali metaboličku ekspertizu na nivou tkiva kod biljaka (9). Ovdje kombinujemo MS/MS-bazirani radni tok sa statističkim okvirom teorije informacija, koju karakteriše metabolička raznolikost u zajedničkoj valuti, kako bismo uporedili ključna predviđanja teorije odbrane biljaka metaboloma indukovanog biljojedima.
Teorijski okviri odbrane biljaka obično su međusobno inkluzivni i mogu se podijeliti u dvije kategorije: one koje pokušavaju objasniti distribuciju metabolita specifičnih za biljke na osnovu odbrambenih funkcija, kao što su optimalna odbrana (OD) (10), teorija pokretnog cilja (MT) (11) i teorija izgleda (12), dok druge traže mehanička objašnjenja o tome kako promjene u dostupnosti resursa utiču na rast biljaka i akumulaciju specijalizovanih metabolita, kao što su hipoteza o ravnoteži ugljika i hranjivih tvari (13), hipoteza o brzini rasta (14) i hipoteza o ravnoteži rasta i diferencijacije (15). Dva seta teorija nalaze se na različitim nivoima analize (4). Međutim, dvije teorije koje uključuju odbrambene funkcije na funkcionalnom nivou dominiraju razgovorom o konstitutivnoj i inducibilnoj odbrani biljaka: OD teorija, koja pretpostavlja da biljke ulažu u svoju skupu hemijsku odbranu samo kada je to potrebno, na primjer, kada ih proguta. Kada travnata životinja napadne, stoga se, prema mogućnosti budućeg napada, dodjeljuje spoj sa odbrambenom funkcijom (10); MT hipoteza pretpostavlja da ne postoji os usmjerene promjene metabolita, već se metabolit mijenja nasumično, stvarajući tako mogućnost ometanja metaboličke "mete kretanja" napadajućih biljojeda. Drugim riječima, ove dvije teorije daju suprotna predviđanja o metaboličkom remodeliranju koje se događa nakon napada biljojeda: odnos između jednosmjerne akumulacije metabolita s odbrambenom funkcijom (OD) i neusmjerenih metaboličkih promjena (MT) (11).
Hipoteze o organskoj strukturi (OD) i metotreksatu (MT) ne uključuju samo inducirane promjene u metabolomu, već i ekološke i evolucijske posljedice akumulacije ovih metabolita, kao što su adaptivni troškovi i koristi ovih metaboličkih promjena u specifičnom ekološkom okruženju (16). Iako obje hipoteze prepoznaju odbrambenu funkciju specijaliziranih metabolita, koji mogu, ali i ne moraju biti skupi, ključno predviđanje koje razlikuje hipoteze o organskoj strukturi (OD) i metotreksatu (MT) leži u usmjerenosti induciranih metaboličkih promjena. Predviđanje teorije o organskoj strukturi (OD) do sada je dobilo najviše eksperimentalne pažnje. Ovi testovi uključuju proučavanje direktnih ili indirektnih odbrambenih funkcija različitih tkiva specifičnih spojeva u staklenicima i prirodnim uvjetima, kao i promjene u fazi razvoja biljaka (17-19). Međutim, do sada, zbog nedostatka radnog toka i statističkog okvira za globalnu sveobuhvatnu analizu metaboličke raznolikosti bilo kojeg organizma, glavna razlika u predviđanju između dvije teorije (to jest, smjer metaboličkih promjena) tek treba biti testirana. Ovdje pružamo takvu analizu.
Jedna od najznačajnijih karakteristika biljno-specifičnih metabolita je njihova ekstremna strukturna raznolikost na svim nivoima, od pojedinačnih biljaka, populacija do sličnih vrsta (20). Mnoge kvantitativne promjene u specijaliziranim metabolitima mogu se uočiti na nivou populacije, dok se jake kvalitativne razlike obično održavaju na nivou vrste (20). Stoga je metabolička raznolikost biljaka glavni aspekt funkcionalne raznolikosti, što odražava prilagodljivost različitim nišama, posebno onim nišama s različitim mogućnostima invazije posebnih insekata i uobičajenih biljojeda (21). Od Fraenkelovog (22) revolucionarnog članka o razlozima postojanja biljno-specifičnih metabolita, interakcije s različitim insektima smatrane su važnim selekcijskim pritiscima, a vjeruje se da su te interakcije oblikovale biljke tokom evolucije. Metabolički put (23). Međuvrsne razlike u raznolikosti specijaliziranih metabolita mogu također odražavati fiziološku ravnotežu povezanu s konstitutivnom i inducibilnom odbranom biljaka od biljojednih strategija, budući da su dvije vrste često negativno korelirane jedna s drugom (24). Iako može biti korisno održavati dobru odbranu u svakom trenutku, pravovremene metaboličke promjene povezane s odbranom pružaju jasne koristi jer omogućavaju biljkama da alociraju vrijedne resurse u druga fiziološka ulaganja (19, 24) i izbjegnu potrebu za simbiozom. Kolateralna šteta (25). Osim toga, ove reorganizacije specijaliziranih metabolita uzrokovane insektima biljojedima mogu dovesti do destruktivne distribucije u populaciji (26) i mogu odražavati direktna očitanja značajnih prirodnih promjena u signalu jasmonske kiseline (JA), koji se može održati u populaciji. Visoki i niski JA signali su kompromisi između odbrane od biljojeda i konkurencije sa specifičnim vrstama (27). Osim toga, specijalizirani biosintetski putevi metabolita će pretrpjeti brz gubitak i transformaciju tokom evolucije, što će rezultirati neujednačenom metaboličkom distribucijom među blisko srodnim vrstama (28). Ovi polimorfizmi se mogu brzo uspostaviti kao odgovor na promjene obrazaca biljojeda (29), što znači da je fluktuacija zajednica biljojeda ključni faktor koji potiče metaboličku heterogenost.
Ovdje smo konkretno riješili sljedeće probleme. (I) Kako biljojedni insekt rekonfigurira biljni metabolom? (Ii) Koje su glavne informacione komponente metaboličke plastičnosti koje se mogu kvantificirati kako bi se testirala predviđanja teorije dugoročne odbrane? (Iii) Da li reprogramirati biljni metabolom na način jedinstven za napadača, ako da, kakvu ulogu biljni hormoni igraju u prilagođavanju specifičnog metaboličkog odgovora i koji metaboliti doprinose specifičnosti odbrane određene vrste? (Iv) Budući da se predviđanja mnogih teorija odbrane mogu proširiti na sve nivoe bioloških tkiva, pitali smo se koliko je konzistentan izazvani metabolički odgovor od internog poređenja do interspecijskog poređenja? U tu svrhu, sistematski smo proučavali metabolom lista nikotina u duhanu, koji je ekološki modelna biljka s bogatim specijaliziranim metabolizmom, a učinkovit je protiv larvi dva domaća biljojeda, Lepidoptera Datura (Ms) (vrlo agresivna, uglavnom se jede). Na Solanaceae i Spodoptera littoralis (Sl), pamukovi lisni crvi su svojevrsni "rod", s biljkama domaćinima Solanaceae i drugim domaćinima drugih rodova i porodica koje služe kao biljna hrana. Analizirali smo MS/MS metabolomski spektar i izdvojili statističke deskriptore informacijske teorije kako bismo uporedili OD i MT teorije. Kreirali smo mape specifičnosti kako bismo otkrili identitet ključnih metabolita. Analiza je proširena na domaću populaciju N. nasi i blisko srodnih vrsta duhana kako bismo dalje analizirali kovarijansu između signalizacije biljnih hormona i indukcije OD.
Kako bismo dobili cjelokupnu mapu plastičnosti i strukture metaboloma lista biljojednog duhana, koristili smo prethodno razvijeni tijek rada za analizu i proračun kako bismo sveobuhvatno prikupili i dekonvoluirali MS/MS spektre visoke rezolucije neovisne o podacima iz biljnih ekstrakata (9). Ova nediferencirana metoda (nazvana MS/MS) može konstruirati neredundantne spektre spojeva, koji se zatim mogu koristiti za sve ovdje opisane analize na nivou spojeva. Ovi dekonvoluirani biljni metaboliti su različitih tipova, koji se sastoje od stotina do hiljada metabolita (ovdje oko 500-1000 s/MS/MS). Ovdje razmatramo metaboličku plastičnost u okviru teorije informacija i kvantificiramo raznolikost i profesionalnost metaboloma na osnovu Shannon-ove entropije distribucije metaboličkih frekvencija. Koristeći prethodno implementiranu formulu (8), izračunali smo skup indikatora koji se mogu koristiti za kvantifikaciju raznolikosti metaboloma (Hj indikator), specijalizacije metaboličkog profila (δj indikator) i metaboličke specifičnosti pojedinačnog metabolita (Si indikator). Pored toga, primijenili smo Indeks plastičnosti relativne udaljenosti (RDPI) kako bismo kvantificirali inducibilnost metaboloma biljojeda (Slika 1A) (30). Unutar ovog statističkog okvira, tretiramo MS/MS spektar kao osnovnu informacionu jedinicu i obrađujemo relativnu zastupljenost MS/MS u mapu distribucije frekvencija, a zatim koristimo Shannon-ovu entropiju za procjenu raznolikosti metaboloma iz nje. Specijalizacija metaboloma mjeri se prosječnom specifičnošću pojedinačnog MS/MS spektra. Stoga se povećanje zastupljenosti nekih MS/MS klasa nakon indukcije biljojeda transformiše u spektralnu inducibilnost, RDPI i specijalizaciju, odnosno povećanje δj indeksa, jer se proizvode specijalizovaniji metaboliti i proizvodi se visok Si indeks. Snižavanje Hj indeksa raznolikosti odražava da se ili smanjuje broj generisanih MS/MS ili se distribucija frekvencija profila mijenja u manje ujednačenom smjeru, uz smanjenje njene ukupne nesigurnosti. Izračunavanjem Si indeksa moguće je istaknuti koje MS/MS induciraju određeni biljojedi, a naprotiv, koje MS/MS ne reagiraju na indukciju, što je ključni pokazatelj za razlikovanje MT i OD predviđanja.
(A) Statistički deskriptori korišteni za inducibilnost podataka (RDPI) MS/MS kod biljojeda (H1 do Hx), raznolikost (Hj indeks), specijalizaciju (δj indeks) i specifičnost metabolita (Si indeks). Povećanje stepena specijalizacije (δj) ukazuje na to da će se, u prosjeku, proizvoditi više metabolita specifičnih za biljojede, dok smanjenje raznolikosti (Hj) ukazuje na smanjenje proizvodnje metabolita ili neravnomjernu distribuciju metabolita na mapi distribucije. Vrijednost Si procjenjuje da li je metabolit specifičan za dato stanje (ovdje, biljojed) ili je obrnuto održavan na istom nivou. (B) Konceptualni dijagram predviđanja teorije odbrane korištenjem ose teorije informacija. OD teorija predviđa da će napad biljojeda povećati metabolite odbrane, čime se povećava δj. Istovremeno, Hj se smanjuje jer se profil reorganizuje prema smanjenoj nesigurnosti metaboličkih informacija. MT teorija predviđa da će napad biljojeda uzrokovati neusmjerene promjene u metabolomu, čime će se povećati Hj kao indikator povećane nesigurnosti metaboličkih informacija i uzrokovati slučajnu distribuciju Si. Također smo predložili mješoviti model, najbolji MT, u kojem će neki metaboliti s višim obrambenim vrijednostima biti posebno povećani (visoka vrijednost Si), dok će drugi pokazivati ​​nasumične odgovore (niža vrijednost Si).
Koristeći deskriptore teorije informacija, interpretiramo OD teoriju kako bismo predvidjeli da će promjene specijalnih metabolita izazvane biljojedima u neinduciranom konstitutivnom stanju dovesti do (i) povećanja metaboličke specifičnosti (Si indeks) što pokreće metabonomsku specifičnost (δj indeks) (povećanje) određenih grupa specijalnih metabolita s većom odbrambenom vrijednošću i (ii) smanjenja raznolikosti metaboloma (Hj indeks) zbog promjene distribucije metaboličke frekvencije prema većoj distribuciji leptinskih tijela. Na nivou pojedinačnog metabolita očekuje se uređena distribucija Si, gdje će metabolit povećati vrijednost Si u skladu sa svojom odbrambenom vrijednošću (Slika 1B). U tom smislu, objašnjavamo MT teoriju kako bismo predvidjeli da će ekscitacija dovesti do (i) neusmjerenih promjena u metabolitima što će rezultirati smanjenjem δj indeksa i (ii) povećanja Hj indeksa zbog povećanja metaboličke nesigurnosti ili slučajnosti, koja se može kvantificirati Shannon entropijom u obliku generalizirane raznolikosti. Što se tiče metaboličkog sastava, MT teorija će predvidjeti slučajnu distribuciju Si. Uzimajući u obzir da se određeni metaboliti nalaze pod specifičnim uslovima, a drugi nisu, te da njihova odbrambena vrijednost zavisi od okoline, predložili smo i model mješovite odbrane, u kojem su δj i Hj raspoređeni u dva pravca duž Si. Povećanjem u svim smjerovima, samo određene grupe metabolita, koje imaju veće odbrambene vrijednosti, će posebno povećati Si, dok će drugi imati slučajnu distribuciju (Slika 1B).
Kako bismo testirali predviđanje redefinirane teorije odbrane na osi deskriptora teorije informacija, podigli smo larve biljojeda ekspertskih (Ms) ili generalističkih (Sl) vrsta na listovima Nepenthes pallens (Slika 2A). Koristeći MS/MS analizu, dobili smo 599 neredundantnih MS/MS spektara (datoteka podataka S1) iz metanolnih ekstrakata tkiva lista prikupljenih nakon hranjenja gusjenica. Korištenje RDPI, Hj i δj indeksa za vizualizaciju rekonfiguracije sadržaja informacija u MS/MS konfiguracijskim datotekama otkriva zanimljive obrasce (Slika 2B). Opći trend je da, kako je opisano deskriptorom informacija, kako gusjenice nastavljaju jesti lišće, stepen sve metaboličke reorganizacije se povećava tokom vremena: 72 sata nakon što biljojed jede, RDPI se značajno povećava. U poređenju sa neoštećenom kontrolom, Hj je značajno smanjen, što je bilo zbog povećanog stepena specijalizacije metaboličkog profila, koji je kvantificiran δj indeksom. Ovaj očigledni trend je u skladu s predviđanjima OD teorije, ali je u suprotnosti s glavnim predviđanjima MT teorije, koja vjeruje da se nasumične (neusmjerene) promjene u nivoima metabolita koriste kao odbrambena kamuflaža (Slika 1B). Iako se sadržaj elicitora oralne sekrecije (OS) i ponašanje hranjenja ova dva biljojeda razlikuju, njihovo direktno hranjenje rezultiralo je sličnim promjenama u smjerovima Hj i δj tokom 24-satnog i 72-satnog perioda žetve. Jedina razlika se javila nakon 72 sata RDPI-ja. U poređenju s onim uzrokovanim hranjenjem Ms, ukupni metabolizam izazvan hranjenjem Sl bio je veći.
(A) Eksperimentalni dizajn: obične svinje (S1) ili ekspertne (Ms) biljojede hrane se desaliniziranim listovima biljaka vrčeva, dok se za simuliranu biljojedu, OS Ms (W + OSMs) koristi za rukovanje ubodom rane na standardiziranim pozicijama lista. S1 (W + OSSl) larve ili voda (W + W). Kontrola (C) je neoštećeni list. (B) Indukcibilnost (RDPI u poređenju sa kontrolnom kartom), raznolikost (Hj indeks) i specijalizacija (δj indeks) izračunati za mapu specijalnih metabolita (599 MS/MS; datoteka S1). Zvjezdice označavaju značajne razlike između direktnog hranjenja biljojeda i kontrolne grupe (Studentov t-test sa parnim t-testom, *P<0,05 i ***P<0,001). ns, nije važno. (C) Indeks vremenske rezolucije glavnog (plavi okvir, aminokiselina, organska kiselina i šećer; datoteka S2) i spektra specijalnih metabolita (crveni okvir 443 MS/MS; datoteka S1) nakon simuliranog tretmana biljojeda. Traka u boji odnosi se na interval pouzdanosti od 95%. Zvjezdica označava značajnu razliku između tretmana i kontrole [kvadratna analiza varijanse (ANOVA), nakon čega slijedi Tukeyjeva iskreno značajna razlika (HSD) za post hoc višestruka poređenja, *P<0,05, **P<0,01 i *** P <0,001]. (D) Specijalizacija dijagrama raspršenja i profila specijalnih metabolita (ponovljeni uzorci s različitim tretmanima).
Kako bismo istražili da li se remodeliranje izazvano biljojedima na nivou metaboloma odražava na promjene u nivou pojedinačnih metabolita, prvo smo se fokusirali na metabolite prethodno proučavane u listovima Nepenthes pallens sa dokazanom otpornošću na biljojede. Fenolni amidi su hidroksicinamamid-poliaminski konjugati koji se akumuliraju tokom procesa biljojeda kod insekata i poznato je da smanjuju performanse insekata (32). Pretražili smo prekursore odgovarajućeg MS/MS i nacrtali njihove kumulativne kinetičke krive (Slika S1). Nije iznenađujuće da su derivati ​​fenola koji nisu direktno uključeni u odbranu od biljojeda, poput hlorogene kiseline (CGA) i rutina, smanjeni nakon biljojeda. Nasuprot tome, biljojedi mogu učiniti fenol amide veoma potentnim. Kontinuirano hranjenje dva biljojeda rezultiralo je gotovo istim spektrom ekscitacije fenolamida, a ovaj obrazac je bio posebno očigledan za de novo sintezu fenolamida. Isti fenomen će se primijetiti prilikom istraživanja puta 17-hidroksigeranil nonandiol diterpenskih glikozida (17-HGL-DTG), koji proizvodi veliki broj acikličnih diterpena sa efikasnim anti-biljojedskim funkcijama (33), od kojih je hranjenje Ms sa Sl izazvalo sličan profil ekspresije (Slika S1).
Mogući nedostatak eksperimenata direktnog hranjenja biljojeda je razlika u brzini konzumiranja lišća i vremenu hranjenja biljojeda, što otežava eliminaciju specifičnih efekata biljojeda uzrokovanih ranama i biljojedima. Kako bismo bolje riješili specifičnost vrste biljojeda u vezi sa induciranim metaboličkim odgovorom lista, simulirali smo hranjenje larvi Ms i Sl tako što smo odmah primijenili svježe prikupljeni OS (OSM i OSS1) na standardnu ​​punkciju W konzistentnih položaja lista. Ovaj postupak se naziva W + OS tretman i standardizira indukciju preciznim tempiranjem početka odgovora koji izaziva biljojed, a da pritom ne izazove zbunjujuće efekte razlika u brzini ili količini gubitka tkiva (Slika 2A) (34). Koristeći MS/MS analizu i proračunski cjevovod, dobili smo 443 MS/MS spektra (datoteka podataka S1), koji su se preklapali sa spektrima prethodno sastavljenim iz eksperimenata direktnog hranjenja. Analiza teorije informacija ovog MS/MS skupa podataka pokazala je da reprogramiranje metaboloma specijaliziranih za list simuliranjem biljojeda pokazuje OS-specifične indukcije (Slika 2C). Posebno, u poređenju sa tretmanom OSS1, OSM je izazvao pojačanje specijalizacije metaboloma nakon 4 sata. Vrijedi napomenuti da je, u poređenju sa eksperimentalnim skupom podataka o direktnom hranjenju biljojeda, metabolička kinetika vizualizirana u dvodimenzionalnom prostoru korištenjem Hj i δj kao koordinata i usmjerenost specijalizacije metaboloma kao odgovor na simulirani tretman biljojeda tokom vremena konzistentno rasla (Slika 2D). Istovremeno, kvantificirali smo sadržaj aminokiselina, organskih kiselina i šećera (datoteka podataka S2) kako bismo istražili da li je ovo ciljano povećanje stručnosti metaboloma posljedica rekonfiguracije centralnog metabolizma ugljika kao odgovor na simulirane biljojede (Slika S2). Da bismo bolje objasnili ovaj obrazac, dalje smo pratili kinetiku metaboličke akumulacije prethodno razmatranih puteva fenolamida i 17-HGL-DTG. Indukcija biljojeda specifična za OS transformira se u diferencijalni obrazac preuređenja unutar metabolizma fenolamida (Slika S3). Fenolni amidi koji sadrže kumarinske i kafeoilne dijelove preferencijalno se induciraju pomoću OSS1, dok OSM-ovi pokreću specifičnu indukciju ferulil konjugata. Za 17-HGL-DTG put, detektirana je diferencijalna indukcija OS-a nizvodnim produktima malonilacije i dimalonilacije (Slika S3).
Zatim smo proučavali plastičnost transkriptoma indukovanu OS koristeći skup podataka mikročipova s ​​vremenskim tokom, koji simulira upotrebu OSM-ova za tretiranje listova biljke rozete kod biljojeda. Kinetika uzorkovanja se u osnovi preklapa s kinetikom korištenom u ovoj studiji metabolomike (35). U poređenju s rekonfiguracijom metaboloma u kojoj se metabolička plastičnost posebno povećava tokom vremena, uočavamo prolazne transkripcijske nalete u listovima izazvane Ms, gdje su inducibilnost transkriptoma (RDPI) i specijalizacija (δj) na 1. Došlo je do značajnog povećanja sati i raznolikosti (Hj) u ovom vremenskom trenutku, ekspresija BMP1 je značajno smanjena, nakon čega slijedi relaksacija specijalizacije transkriptoma (Slika S4). Porodice metaboličkih gena (kao što su P450, glikoziltransferaza i BAHD aciltransferaza) učestvuju u procesu sastavljanja posebnih metabolita iz strukturnih jedinica izvedenih iz primarnog metabolizma, slijedeći prethodno spomenuti rani model visoke specijalizacije. Kao studija slučaja, analiziran je put fenilalanina. Analiza je potvrdila da su osnovni geni u metabolizmu fenolamida visoko OS-inducirani kod biljojeda u poređenju sa biljkama koje nisu privučene, te da su blisko usklađeni u svojim obrascima ekspresije. Transkripcijski faktor MYB8 i strukturni geni PAL1, PAL2, C4H i 4CL uzvodno od ovog puta pokazali su ranu inicijaciju transkripcije. Aciltransferaze koje igraju ulogu u konačnom sastavljanju fenolamida, kao što su AT1, DH29 i CV86, pokazuju produženi obrazac pojačane regulacije (Slika S4). Gornja zapažanja ukazuju na to da su rana inicijacija specijalizacije transkriptoma i kasnije pojačanje metabolomske specijalizacije povezani način rada, što može biti posljedica sinhronog regulatornog sistema koji pokreće snažan odbrambeni odgovor.
Rekonfiguracija u signalizaciji biljnih hormona djeluje kao regulatorni sloj koji integrira informacije o biljojedima kako bi reprogramirao fiziologiju biljaka. Nakon simulacije biljojeda, izmjerili smo kumulativnu dinamiku ključnih kategorija biljnih hormona i vizualizirali vremensku koekspresiju između njih [Pearsonov koeficijent korelacije (PCC) > 0,4] (Slika 3A). Kao što se i očekivalo, biljni hormoni povezani s biosintezom povezani su unutar mreže koekspresije biljnih hormona. Osim toga, metabolička specifičnost (Si indeks) je mapirana na ovu mrežu kako bi se istaknuli biljni hormoni inducirani različitim tretmanima. Nacrtana su dva glavna područja specifičnog odgovora biljojeda: jedno je u JA klasteru, gdje JA (njegov biološki aktivni oblik JA-Ile) i drugi JA derivati ​​pokazuju najviši Si rezultat; drugo je etilen (ET). Giberelin je pokazao samo umjereno povećanje specifičnosti biljojeda, dok su drugi biljni hormoni, poput citokinina, auksina i abscisinske kiseline, imali nisku indukcijsku specifičnost za biljojede. U poređenju sa korištenjem samo W + W, amplifikacija vršne vrijednosti JA derivata putem primjene OS (W + OS) može se u osnovi transformirati u snažan specifični indikator JA. Neočekivano, poznato je da OSM i OSS1 sa različitim sadržajem elicitora uzrokuju sličnu akumulaciju JA i JA-Ile. Za razliku od OSS1, OSM je specifično i snažno induciran OSM-ovima, dok OSS1 ne amplificira odgovor bazalnih rana (Slika 3B).
(A) Analiza mreže koekspresije zasnovana na PCC proračunu simulacije kinetike akumulacije biljnih hormona indukovanih biljojedima. Čvor predstavlja jedan biljni hormon, a veličina čvora predstavlja Si indeks specifičan za biljni hormon između tretmana. (B) Akumulacija JA, JA-Ile i ET u listovima uzrokovana različitim tretmanima označena je različitim bojama: kajsija, W + OSM; plava, W + OSSl; crna, W + W; siva, C (kontrola). Zvjezdice označavaju značajne razlike između tretmana i kontrole (dvosmjerna ANOVA nakon koje slijedi Tukey HSD post hoc višestruka usporedba, *** P <0,001). Analiza teorije informacija (C)697 MS/MS (datoteka podataka S1) u biosintezi JA i spektru oštećene percepcije (irAOC i irCOI1) i (D)585 MS/MS (datoteka podataka S1) u ETR1 sa oštećenim ET signalom. Dva simulirana tretmana biljojeda aktivirala su linije biljaka i kontrolne biljke s praznim vozilom (EV). Zvjezdice označavaju značajne razlike između tretmana W+OS i neoštećene kontrole (dvosmjerna ANOVA nakon koje slijedi Tukey HSD post hoc višestruka usporedba, *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001). (E) Raspršeni grafovi raspršenog protivljenja specijalizaciji. Boje predstavljaju različite genetski modificirane sojeve; simboli predstavljaju različite metode tretmana: trokut, W + OSS1; pravokutnik, W + OSM; krug C
Zatim, koristimo genetski modificirani soj atenuiranih Nepenthesa (irCOI1 i sETR1) u ključnim koracima biosinteze JA i ET (irAOC i irACO) i percepcije (irCOI1 i sETR1) kako bismo analizirali metabolizam ova dva biljna hormona na biljojedima. Relativni doprinos reprogramiranja. U skladu s prethodnim eksperimentima, potvrdili smo indukciju biljojed-OS u biljkama s praznim nosačima (EV) (Slika 3, C do D) i ukupno smanjenje Hj indeksa uzrokovano OSM-om, dok se δj indeks povećao. Odgovor je izraženiji od odgovora izazvanog OSS1. Dvolinijski grafikon koji koristi Hj i δj kao koordinate pokazuje specifičnu deregulaciju (Slika 3E). Najočitiji trend je da su kod sojeva kojima nedostaje JA signal, raznolikost metaboloma i promjene specijalizacije uzrokovane biljojedima gotovo u potpunosti eliminirane (Slika 3C). Nasuprot tome, tiha percepcija ET signala kod sETR1 biljaka, iako je ukupni učinak na promjene u metabolizmu biljojeda mnogo niži od učinka JA signalizacije, smanjuje razliku u Hj i δj indeksima između OSM i OSS1 ekscitacija (Slika 3D i Slika S5). Ovo ukazuje na to da pored osnovne funkcije transdukcije JA signala, transdukcija ET signala služi i kao fino podešavanje specifičnog metaboličkog odgovora biljojeda. U skladu s ovom funkcijom finog podešavanja, nije bilo promjene u ukupnoj inducibilnosti metaboloma kod sETR1 biljaka. S druge strane, u poređenju sa sETR1 biljkama, irACO biljke su inducirale slične ukupne amplitude metaboličkih promjena uzrokovanih biljojedima, ali su pokazale značajno različite Hj i δj rezultate između OSM i OSS1 izazova (Slika S5).
Kako bismo identificirali specijalizirane metabolite koji imaju važan doprinos specifičnom odgovoru biljojeda i fino podesili njihovu proizvodnju putem ET signala, koristili smo prethodno razvijenu strukturnu MS/MS metodu. Ova metoda se oslanja na metodu bi-klasteriranja kako bi se ponovo zaključila metabolička porodica iz MS/MS fragmenata [normalizirani skalarni proizvod (NDP)] i rezultata sličnosti na osnovu neutralnog gubitka (NL). Skup podataka MS/MS konstruiran analizom ET transgenih linija proizveo je 585 MS/MS (datoteka podataka S1), što je razlučeno njihovim grupiranjem u sedam glavnih MS/MS modula (M) (Slika 4A). Neki od ovih modula su gusto zbijeni prethodno okarakteriziranim posebnim metabolitima: na primjer, M1, M2, M3, M4 i M7 su bogati raznim derivatima fenola (M1), flavonoidnim glikozidima (M2), acil šećerima (M3 i M4) i 17-HGL-DTG (M7). Pored toga, izračunavaju se metabolički specifične informacije (Si indeks) pojedinačnog metabolita u svakom modulu, a njegova Si distribucija se može intuitivno vidjeti. Ukratko, MS/MS spektri koji pokazuju visoku specifičnost za herbivornost i genotip karakteriziraju se visokim vrijednostima Si, a statistika kurtoze ukazuje na distribuciju krzna na desnom uglu repa. Jedna takva distribucija mršavog koloida otkrivena je u M1, u kojem je fenol amid pokazao najveću frakciju Si (Slika 4B). Prethodno spomenuti herbivorni inducibilni 17-HGL-DTG u M7 pokazao je umjereni Si rezultat, što ukazuje na umjereni stepen diferencijalne regulacije između dva OS tipa. Nasuprot tome, većina konstitutivno proizvedenih specijaliziranih metabolita, poput rutina, CGA i acil šećera, među najnižim su Si rezultatima. Kako bi se bolje istražila strukturna složenost i distribucija Si između posebnih metabolita, konstruirana je molekularna mreža za svaki modul (Slika 4B). Važno predviđanje OD teorije (sažeto na slici 1B) je da bi reorganizacija posebnih metabolita nakon biljojeda trebala dovesti do jednosmjernih promjena u metabolitima s visokom odbrambenom vrijednošću, posebno povećanjem njihove specifičnosti (za razliku od slučajne distribucije) Način) Odbrambeni metabolit predviđen MT teorijom. Većina fenolnih derivata akumuliranih u M1 funkcionalno je povezana sa smanjenjem performansi insekata (32). Prilikom poređenja vrijednosti Si u M1 metabolitima između induciranih listova i konstitutivnih listova kontrolnih EV biljaka nakon 24 sata, primijetili smo da metabolička specifičnost mnogih metabolita nakon biljojeda ima značajan trend rasta (Slika 4C). Specifično povećanje vrijednosti Si otkriveno je samo kod odbrambenih fenolamidima, ali nije otkriveno povećanje vrijednosti Si kod drugih fenola i nepoznatih metabolita koji koegzistiraju u ovom modulu. Ovo je specijalizirani model koji je povezan s OD teorijom. Glavna predviđanja metaboličkih promjena uzrokovanih biljojedima su konzistentna. Kako bismo testirali da li je ova specifičnost fenolamidnog spektra izazvana OS-specifičnim ET-om, grafički smo prikazali indeks metabolita Si i uzrokovali diferencijalnu vrijednost ekspresije između OSM i OSS1 u EV i sETR1 genotipovima (Slika 4D). Kod sETR1, razlika izazvana fenamidom između OSM i OSS1 bila je znatno smanjena. Metoda bi-klasteriranja je također primijenjena na MS/MS podatke prikupljene u sojevima s nedovoljnim JA kako bi se zaključili glavni MS/MS moduli povezani s JA-reguliranom metaboličkom specijalizacijom (Slika S6).
(A) Rezultati klasteriranja 585 MS/MS na osnovu zajedničkih fragmenata (sličnost NDP) i zajedničkih neutralnih gubitaka (sličnost NL) rezultiraju modulom (M) koji je konzistentan sa poznatom porodicom jedinjenja ili nepoznatim ili slabo metaboliziranim sastavom metabolita. Pored svakog modula prikazana je specifična (Si) distribucija metabolita (MS/MS). (B) Modularna molekularna mreža: Čvorovi predstavljaju MS/MS i ivice, NDP (crveno) i NL (plavo) MS/MS rezultate (granična vrijednost, > 0,6). Indeks specifičnosti graduiranog metabolita (Si) obojen na osnovu modula (lijevo) i mapiran na molekularnu mrežu (desno). (C) Modul M1 EV biljke u konstitutivnom (kontrola) i indukovanom stanju (simulirani biljojed) nakon 24 sata: dijagram molekularne mreže (vrijednost Si je veličina čvora, defanzivni fenolamid je označen plavom bojom). (D) Dijagram molekularne mreže M1 spektralne linije sETR1 sa oštećenom EV i ET percepcijom: fenolni spoj predstavljen zelenim kružnim čvorom i značajna razlika (P vrijednost) između tretmana W + OSM i W + OSS1 kao veličina čvora. CP, N-kafeoil-tirozin; CS, N-kafeoil-spermidin; FP, N-ferulinska kiselina ester-urinska kiselina; FS, N-ferulil-spermidin; CoP, N', N “-kumarolil-tirozin; DCS, N', N”-dikafeoil-spermidin; CFS, N', N”-kafeoil, feruloil-spermidin; Lycium barbarum u vučjoj bobici Son; Nick. O-AS, O-acil šećer.
Analizu smo proširili sa jednog atenuiranog genotipa Nepenthes na prirodne populacije, gdje su prethodno opisane jake intraspecifične promjene u nivoima JA kod biljojeda i specifičnim nivoima metabolita u prirodnim populacijama (26). Koristite ovaj skup podataka da obuhvatite 43 germplazme. Ove germplazme se sastoje od 123 vrste biljaka iz N. pallens. Ove biljke su uzete iz sjemena sakupljenog u različitim autohtonim staništima u Utahu, Nevadi, Arizoni i Kaliforniji (Slika S7), izračunali smo raznolikost metaboloma (ovdje nazvanu nivo populacije) β raznolikost) i specijalizaciju uzrokovanu OSM-om. U skladu s prethodnim studijama, uočili smo širok raspon metaboličkih promjena duž Hj i δj osa, što ukazuje na to da germplazme imaju značajne razlike u plastičnosti svojih metaboličkih odgovora na biljojede (Slika S7). Ova organizacija podsjeća na prethodna zapažanja o dinamičkom rasponu promjena JA uzrokovanih biljojedima i održala je vrlo visoku vrijednost u jednoj populaciji (26, 36). Korištenjem JA i JA-Ile za testiranje ukupne korelacije nivoa između Hj i δj, otkrili smo da postoji značajna pozitivna korelacija između JA i indeksa raznolikosti i specijalizacije metaboloma β (Slika S7). Ovo ukazuje na to da bi heterogenost u indukciji JA izazvana biljojedima, otkrivena na nivou populacije, mogla biti posljedica ključnih metaboličkih polimorfizama uzrokovanih selekcijom insekata biljojeda.
Prethodne studije su pokazale da se vrste duhana uveliko razlikuju po vrsti i relativnoj zavisnosti od indukovane i konstitutivne metaboličke odbrane. Vjeruje se da su ove promjene u transdukciji signala protiv biljojeda i odbrambenim sposobnostima regulisane pritiskom populacije insekata, životnim ciklusom biljke i troškovima proizvodnje odbrane u niši u kojoj data vrsta raste. Proučavali smo konzistentnost preoblikovanja metaboloma lista izazvanog biljojedima šest vrsta Nicotiana porijeklom iz Sjeverne i Južne Amerike. Ove vrste su blisko povezane sa Nepenthes North America, naime Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. atenuirana trava, Nicotiana tabacum, linearni duhan, duhan (Nicotiana spegazzinii) i duhan od lista duhana (Nicotiana obtusifolia) (Slika 5A) (37). Šest ovih vrsta, uključujući dobro okarakterisanu vrstu N. please, su jednogodišnje biljke klade petunia, a obtusifolia N. su trajnice sestrinske klade Trigonophyllae (38). Nakon toga, indukcija W + W, W + OSM i W + OSS1 je izvršena na ovih sedam vrsta kako bi se proučilo metaboličko preuređenje ishrane insekata na nivou vrste.
(A) Bootstrap filogenetsko stablo zasnovano na maksimalnoj vjerovatnoći [za sintezu nuklearnog glutamina (38)] i geografskoj distribuciji sedam blisko srodnih vrsta Nicotiana (različite boje) (37). (B) Dijagram raspršenja specijalizirane raznolikosti za metaboličke profile sedam vrsta Nicotiana (939 MS/MS; datoteka S1). Na nivou vrste, raznolikost metaboloma je negativno korelirana sa stepenom specijalizacije. Analiza korelacije na nivou vrste između metaboličke raznolikosti i specijalizacije i akumulacije JA prikazana je na Slici 2. S9. Boja, različite vrste; trougao, W + OSS1; pravougaonik, W + OSM; (C) Dinamika JA i JA-Ile kod Nicotiana je rangirana prema amplitudi pobuđivanja OS (dvosmjerna ANOVA i Tukey HSD nakon višestrukog poređenja, * P <0,05, ** P <0,01 i * ** Za poređenje W + OS i W + W, P <0,001). Box dijagram (D) raznolikosti i (E) specijalizacije svake vrste nakon simuliranja biljojeda i metil JA (MeJA). Zvjezdica označava značajnu razliku između W + OS i W + W ili lanolin plus W (Lan + W) ili Lan plus MeJA (Lan + MeJa) i Lan kontrole (dvosmjerna analiza varijanse, nakon čega slijedi Tukeyjeva HSD post hoc višestruka usporedba, *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001).
Koristeći metodu dvostrukog klastera, identificirali smo 9 modula od 939 MS/MS (datoteka podataka S1). Sastav MS/MS rekonfiguriranih različitim tretmanima uveliko varira među različitim modulima i vrstama (Slika S8). Vizualizacija Hj (ovdje se naziva γ-raznolikost na nivou vrste) i δj otkriva da se različite vrste agregiraju u vrlo različite grupe u metaboličkom prostoru, gdje je podjela na nivou vrste obično izraženija od ekscitacije. S izuzetkom N. linear i N. obliquus, one pokazuju širok dinamički raspon indukcionih efekata (Slika 5B). Nasuprot tome, vrste poput N. purpurea i N. obtusifolia imaju manje očigledan metabolički odgovor na tretman, ali je metabolom raznolikiji. Distribucija indukovanog metaboličkog odgovora specifična za vrstu rezultirala je značajnom negativnom korelacijom između specijalizacije i gama raznolikosti (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Promjene u nivoima JA izazvane OS-om pozitivno su korelirane sa specijalizacijom metaboloma, a negativno su korelirane sa metaboličkom gama raznolikošću koju pokazuje svaka vrsta (Slika 5B i Slika S9). Vrijedi napomenuti da su vrste koje se kolokvijalno nazivaju vrstama sa "signalnim odgovorom" na Slici 5C, kao što su Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute i Nepenthes attenuated, izazvale značajne znakove nakon 30 minuta. Nedavne OS-specifične epidemije JA i JA-Ile, dok druge bakterije nazvane "signalno nereagirajuće", kao što su Nepenthes mills, Nepenthes powdery i N. obtusifolia, pokazuju samo JA-Ile Edge indukciju bez ikakve OS specifičnosti (Slika 5C). Na metaboličkom nivou, kao što je gore spomenuto, za atenuirane Nepenthes, signalno reagujuće supstance pokazale su OS specifičnost i značajno povećale δj, dok su smanjile Hj. Ovaj OS-specifičan efekat prajminga nije otkriven kod vrsta klasifikovanih kao signalno nereagujuće vrste (Slika 5, D i E). Metaboliti specifični za OS se češće dijele između vrsta koje reaguju na signal, a ovi signalni klasteri se grupišu sa vrstama sa slabijim signalnim odgovorima, dok vrste sa slabijim signalnim odgovorima pokazuju manju međuzavisnost (Slika S8). Ovaj rezultat ukazuje na to da su indukcija JA specifična za OS i rekonfiguracija nizvodnog metaboloma specifična za OS povezane na nivou vrste.
Zatim smo koristili lanolin pastu koja sadrži metil JA (MeJA) za tretiranje biljaka kako bismo istražili da li su ovi načini spajanja ograničeni dostupnošću JA primijenjenog egzogenim JA, koji će biti u citoplazmi biljaka. Brza deesterifikacija je JA. Otkrili smo isti trend postepene promjene od vrsta koje reaguju na signal do vrsta koje ne reaguju na signal, uzrokovan kontinuiranom opskrbom JA (Slika 5, D i E). Ukratko, tretman MeJA snažno je reprogramirao metabolome linearnih nematoda, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens i N. mikimotoi, što je rezultiralo značajnim povećanjem δj i smanjenjem Hj. Samo N. purpurea je pokazala povećanje δj, ali ne i Hj. N. obtusifolia, za koju je prethodno pokazano da akumulira izuzetno niske nivoe JA, također slabo reaguje na tretman MeJA u smislu rekonfiguracije metaboloma. Ovi rezultati ukazuju na to da je proizvodnja JA ili transdukcija signala fiziološki ograničena kod vrsta koje ne reaguju na signal. Da bismo testirali ovu hipotezu, proučavali smo četiri vrste (N. pallens, N. mills, N. pink i N. microphylla) indukovane transkriptomom W + W, W + OSM i W + OSS1 (39). U skladu s obrascem remodeliranja metaboloma, vrste su dobro odvojene u transkriptomskom prostoru, među kojima je N. attenuated pokazao najveći OS-inducirani RDPI, dok je N. gracilis imao najniži (Slika 6A). Međutim, utvrđeno je da je transkriptomska raznolikost indukovana od strane N. oblonga bila najniža među četiri vrste, suprotno najvećoj metabonomskoj raznolikosti N. oblonga koja je prethodno prikazana kod sedam vrsta. Prethodne studije su pokazale da skup gena povezanih s ranim odbrambenim signalima, uključujući JA signale, objašnjava specifičnost ranih odbrambenih odgovora induciranih elicitorima povezanim s biljojedima kod vrsta Nicotiana (39). Poređenje JA signalnih puteva između ove četiri vrste otkrilo je zanimljiv obrazac (Slika 6B). Većina gena u ovom putu, kao što su AOC, OPR3, ACX i COI1, pokazala je relativno visoke nivoe indukcije kod ove četiri vrste. Međutim, ključni gen, JAR4, pretvara JA u njegov biološki aktivni oblik akumuliranih transkripata JA-Ile, a njegov nivo transkripcije je vrlo nizak, posebno kod N. mills, Nepenthes pieris i N. microphylla. Osim toga, samo transkript drugog gena AOS nije detektovan kod N. bifidum. Ove promjene u ekspresiji gena mogu biti odgovorne za ekstremne fenotipove izazvane niskom produkcijom JA kod signalno anergičnih vrsta i indukcijom N. gracilis.
(A) Analiza teorije informacija o reprogramiranju ranih transkripcijskih odgovora četiri blisko srodne vrste duhana uzorkovane 30 minuta nakon indukcije biljojeda. RDPI se izračunava poređenjem listova induciranih OS biljojeda s kontrolnom grupom rane. Boje označavaju različite vrste, a simboli označavaju različite metode tretmana. (B) Analiza ekspresije gena u JA signalnim putevima među četiri vrste. Pojednostavljeni JA put je prikazan pored box plot-a. Različite boje označavaju različite metode obrade. Zvjezdica označava da postoji značajna razlika između W + OS tretmana i W + W kontrole (za Studentov t-test za parne razlike, *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001). OPDA, 12-oksofitodienska kiselina; OPC-8: 0,3-okso-2(2′(Z)-pentenil)-ciklopentan-1-oktanska kiselina.
U posljednjem dijelu proučavali smo kako specifično preoblikovanje metaboloma insekata različitih biljnih vrsta može biti otporno na biljojede. Prethodna istraživanja su se fokusirala na rod Nicotiana. Njihova otpornost na Ms i larve se uveliko razlikuje (40). Ovdje smo proučavali vezu između ovog modela i njihove metaboličke plastičnosti. Koristeći gore navedene četiri vrste duhana i testirajući korelaciju između raznolikosti i specijalizacije metaboloma uzrokovanog biljojedima i otpornosti biljaka na Ms i Sl, otkrili smo da su otpornost, raznolikost i specijalizacija na generalistički Sl pozitivno korelirane, dok je korelacija između otpornosti na ekspertne dame i specijalizacije slaba, a korelacija s raznolikošću nije značajna (Slika S10). Što se tiče otpornosti na S1, i atenuirani N. chinensis i N. gracilis, za koje je prethodno pokazano da pokazuju i nivoe transdukcije JA signala i plastičnost metaboloma, imali su uveliko različite odgovore na indukciju biljojeda, a također su pokazali sličnu visoku otpornost. Spol.
U proteklih šezdeset godina, teorija odbrane biljaka pružila je teorijski okvir, na osnovu kojeg su istraživači predvidjeli značajan broj evolucije i funkcija biljnih specijalizovanih metabolita. Većina ovih teorija ne slijedi normalnu proceduru jakih zaključaka (41). One predlažu ključna predviđanja (3) na istom nivou analize. Kada testiranje ključnih predviđanja omogući analizu specifičnih teorija, to će učiniti da se područje kreće naprijed. Biti podržan, ali odbaciti druge (42). Umjesto toga, nova teorija daje predviđanja na različitim nivoima analize i dodaje novi sloj deskriptivnih razmatranja (42). Međutim, dvije teorije predložene na funkcionalnom nivou, MT i OD, mogu se lako objasniti kao važna predviđanja specijalizovanih metaboličkih promjena uzrokovanih biljojedima: OD teorija vjeruje da su promjene u specijalizovanom metaboličkom "prostoru" visoko usmjerene. MT teorija vjeruje da će ove promjene biti neusmjerene i nasumično locirane u metaboličkom prostoru, te da imaju tendenciju da imaju metabolite visoke odbrambene vrijednosti. Prethodna ispitivanja OD i MT predviđanja testirana su korištenjem uskog skupa a priori "odbrambenih" spojeva. Ovi testovi usmjereni na metabolit onemogućavaju analizu obima i putanje rekonfiguracije metaboloma tokom herbivorije i ne dozvoljavaju testiranje unutar konzistentnog statističkog okvira koje zahtijeva ključna predviđanja koja se mogu smatrati cjelinom. Kvantificirajte promjene u metabolomu biljaka. Ovdje smo koristili inovativnu tehnologiju u metabolomici zasnovanu na računarskoj MS i izvršili dekonvolucijsku MS analizu u općoj valuti deskriptora teorije informacija kako bismo testirali razliku između dva predložena na globalnom nivou metabolomike. Ključno predviđanje ove teorije. Teorija informacija primijenjena je u mnogim oblastima, posebno u kontekstu istraživanja biodiverziteta i protoka hranjivih tvari (43). Međutim, koliko znamo, ovo je prva primjena koja se koristi za opisivanje metaboličkog informacijskog prostora biljaka i rješavanje ekoloških problema vezanih za privremene metaboličke promjene kao odgovor na znakove iz okoline. Posebno, sposobnost ove metode leži u njenoj sposobnosti da uporedi obrasce unutar i između biljnih vrsta kako bi se ispitalo kako su biljojedi evoluirali od različitih vrsta do međuvrstnih makroevolucijskih obrazaca na različitim nivoima evolucije. Metabolizam.
Analiza glavnih komponenti (PCA) pretvara multivarijantni skup podataka u prostor redukcije dimenzionalnosti tako da se može objasniti glavni trend podataka, pa se obično koristi kao istraživačka tehnika za parsiranje skupa podataka, kao što je dekonvolucijski metabolom. Međutim, redukcija dimenzionalnosti će izgubiti dio informativnog sadržaja u skupu podataka, a PCA ne može pružiti kvantitativne informacije o karakteristikama koje su posebno relevantne za ekološku teoriju, kao što su: kako biljojedi rekonfiguriraju raznolikost u specijaliziranim područjima (na primjer, bogatstvo, distribucija) i brojnost) metaboliti? Koji metaboliti su prediktori induciranog stanja datog biljojeda? Iz perspektive specifičnosti, raznolikosti i inducibilnosti, informativni sadržaj profila metabolita specifičnog za list se dekomponira i utvrđeno je da jedenje biljojeda može aktivirati specifični metabolizam. Neočekivano smo primijetili da, kao što je opisano u implementiranim indikatorima teorije informacija, rezultirajuća metabolička situacija ima veliko preklapanje nakon napada dva biljojeda (generalista koji se hrani noću Sl) i stručnjaka za Solanaceae Ms. Iako su njihovo ponašanje hranjenja i koncentracija značajno različiti. Inicijator konjugata masnih kiselina i aminokiselina (FAC) u OS (31). Korištenjem biljojednog OS za liječenje standardiziranih ubodnih rana, simulirani tretman biljojeda također je pokazao sličan trend. Ovaj standardizirani postupak za simuliranje odgovora biljaka na napade biljojeda eliminira zbunjujuće faktore uzrokovane promjenama u prehrambenom ponašanju biljojeda, što dovodi do različitih stepena oštećenja u različito vrijeme (34). FAC, za koji se zna da je glavni uzrok OSM-a, smanjuje odgovore JAS-a i drugih biljnih hormona u OSS1, dok OSS1 smanjuje stotine puta (31). Međutim, OSS1 je uzrokovao slične nivoe akumulacije JA u poređenju sa OSM-om. Prethodno je pokazano da je odgovor JA kod atenuiranih Nepenthesa vrlo osjetljiv na OSM, gdje FAC može održati svoju aktivnost čak i ako je razrijeđen 1:1000 s vodom (44). Stoga, u poređenju sa OSM-om, iako je FAC u OSS1 vrlo nizak, dovoljan je da izazove dovoljnu izbijanje JA. Prethodne studije su pokazale da se proteini slični porinu (45) i oligosaharidi (46) mogu koristiti kao molekularni tragovi za pokretanje odbrambenih odgovora biljaka u OSS1. Međutim, još uvijek nije jasno da li su ovi elicitori u OSS1 odgovorni za akumulaciju JA uočenu u trenutnoj studiji.
Iako postoji malo studija koje opisuju diferencijalne metaboličke otiske prstiju uzrokovane primjenom različitih biljojeda ili egzogenih JA ili SA (salicilne kiseline) (47), niko nije poremetio perturbaciju specifičnu za vrstu biljojeda u mreži biljaka i njene efekte na specifične lične podatke. Ukupni uticaj metabolizma se sistematski proučava. Ova analiza je dodatno potvrdila da veza unutrašnje hormonske mreže sa drugim biljnim hormonima, osim JA, oblikuje specifičnost metaboličke reorganizacije uzrokovane biljojedima. Konkretno, otkrili smo da je ET uzrokovan OSM-om bio značajno veći od onog uzrokovanog OSS1. Ovaj način je u skladu sa većim sadržajem FAC u OSM-u, što je neophodan i dovoljan uslov za pokretanje ET naleta (48). U kontekstu interakcije između biljaka i biljojeda, signalna funkcija ET-a na dinamiku metabolita specifičnih za biljke je još uvijek sporadična i cilja samo na jednu grupu jedinjenja. Pored toga, većina studija je koristila egzogenu primjenu ET-a ili njegovih prekursora ili različitih inhibitora za proučavanje regulacije ET-a, među kojima će ove egzogene hemijske primjene proizvesti mnoge nespecifične nuspojave. Koliko znamo, ova studija predstavlja prvo veliko sistematsko ispitivanje uloge ET-a u korištenju ET-a za proizvodnju i percepciju oštećenih transgeničnih biljaka radi koordinacije dinamike metaboloma biljaka. Indukcija ET-a specifična za biljojede može u konačnici modulirati odgovor metaboloma. Najznačajnija je transgenična manipulacija genima biosinteze (ACO) i percepcije (ETR1) ET-a koja je otkrila de novo akumulaciju fenolamida specifičnu za biljojede. Prethodno je pokazano da ET može fino podesiti akumulaciju nikotina izazvanu JA regulacijom putrescin N-metiltransferaze (49). Međutim, sa mehaničke tačke gledišta, nije jasno kako ET fino podešava indukciju fenamida. Pored funkcije transdukcije signala ET-a, metabolički tok se također može preusmjeriti na S-adenozil-1-metionin kako bi se regulisalo ulaganje u poliaminofenol amide. S-adenozil-1-metionin je ET i uobičajeni međuprodukt biosintetskog puta poliamina. Mehanizam kojim ET signal reguliše nivo fenolamida zahtijeva daljnja istraživanja.
Dugo vremena, zbog velikog broja posebnih metabolita nepoznate strukture, intenzivna pažnja posvećena specifičnim metaboličkim kategorijama nije bila u stanju striktno procijeniti vremenske promjene metaboličke raznolikosti nakon bioloških interakcija. Trenutno, na osnovu analize teorije informacija, glavni rezultat MS/MS spektralne akvizicije zasnovane na nepristrasnim metabolitima je da biljojedi koji jedu ili simuliraju biljojede nastavljaju smanjivati ​​ukupnu metaboličku raznolikost metaboloma lista, a istovremeno povećavaju stepen njegove specijalizacije. Ovo privremeno povećanje specifičnosti metaboloma uzrokovano biljojedima povezano je sa sinergističkim povećanjem specifičnosti transkriptoma. Karakteristika koja najviše doprinosi ovoj većoj specijalizaciji metaboloma (koja ima veću vrijednost Si) je poseban metabolit sa prethodno okarakterisanom biljojedskom funkcijom. Ovaj model je u skladu sa predviđanjem teorije OD, ali predviđanje MT-a povezano sa slučajnošću reprogramiranja metaboloma nije konzistentno. Međutim, ovi podaci su također u skladu sa predviđanjem miješanog modela (najbolji MT; Slika 1B), jer drugi nekarakterizirani metaboliti sa nepoznatim odbrambenim funkcijama i dalje mogu slijediti slučajnu distribuciju Si.
Značajan obrazac koji je dodatno uočeno ovim istraživanjem je da se od nivoa mikroevolucije (jedna biljka i populacija duhana) do veće evolucijske skale (blisko srodne vrste duhana), različiti nivoi evolucijske organizacije nalaze u "najboljoj odbrani". Postoje značajne razlike u sposobnostima biljojeda. Moore i saradnici (20) i Kessler i Kalske (1) nezavisno su predložili pretvaranje tri funkcionalna nivoa biodiverziteta koje je prvobitno razlikovao Whittaker (50) u konstitutivne i indukovane vremenske promjene hemijske raznolikosti; ovi autori nisu saželi ni procedure za prikupljanje podataka o metabolomima velikih razmjera također ne opisuju kako izračunati metaboličku raznolikost iz ovih podataka. U ovoj studiji, manje prilagodbe Whittakerove funkcionalne klasifikacije će razmatrati α-metaboličku raznolikost kao raznolikost MS/MS spektara u datoj biljci, a β-metaboličku raznolikost kao osnovni intraspecifični metabolizam grupe populacija, a γ-metaboličku raznolikost će biti proširenje analize sličnih vrsta.
JA signal je neophodan za širok spektar metaboličkih odgovora biljojeda. Međutim, nedostaje rigorozno kvantitativno testiranje doprinosa intraspecifične regulacije biosinteze JA raznolikosti metaboloma, a još uvijek nije jasno da li je JA signal opće mjesto za metaboličku diverzifikaciju izazvanu stresom na višoj makroevolucijskoj skali. Primijetili smo da biljojeda priroda biljojeda Nepenthes inducira specijalizaciju metaboloma i da je varijacija specijalizacije metaboloma unutar populacije vrsta Nicotiana i među blisko srodnim vrstama Nicotiana sistematski pozitivno korelirana sa JA signalizacijom. Osim toga, kada je JA signal oštećen, metabolička specifičnost izazvana jednim genotipom biljojeda bit će poništena (Slika 3, C i E). Budući da su promjene metaboličkog spektra prirodno atenuiranih populacija Nepenthes uglavnom kvantitativne, promjene u metaboličkoj β raznolikosti i specifičnosti u ovoj analizi mogu biti uglavnom uzrokovane jakom ekscitacijom kategorija spojeva bogatih metabolitima. Ove klase spojeva dominiraju dijelom profila metaboloma i dovode do pozitivne korelacije sa JA signalima.
Budući da su biohemijski mehanizmi vrsta duhana koje su mu blisko povezane vrlo različiti, metaboliti su specifično identificirani u kvalitativnom aspektu, tako da je to analitičnije. Obrada snimljenog metaboličkog profila od strane informacijske teorije otkriva da indukcija biljojeda pogoršava kompromis između metaboličke gama raznolikosti i specijalizacije. JA signal igra centralnu ulogu u ovom kompromisu. Povećanje specijalizacije metaboloma u skladu je s glavnim predviđanjem OD i pozitivno je korelirano sa JA signalom, dok je JA signal negativno koreliran s metaboličkom gama raznolikošću. Ovi modeli pokazuju da je OD kapacitet biljaka uglavnom određen plastičnošću JA, bilo na mikroevolucijskoj skali ili na većoj evolucijskoj skali. Eksperimenti primjene egzogenog JA koji zaobilaze defekte biosinteze JA dodatno otkrivaju da se blisko povezane vrste duhana mogu razlikovati na vrste koje reaguju na signal i vrste koje ne reaguju na signal, baš kao i njihov način JA i plastičnost metaboloma inducirana biljojedima. Vrste koje ne reaguju na signal ne mogu odgovoriti zbog svoje nemogućnosti da proizvode endogeni JA i stoga su podložne fiziološkim ograničenjima. Ovo može biti uzrokovano mutacijama u nekim ključnim genima u JA signalnom putu (AOS i JAR4 kod N. crescens). Ovaj rezultat naglašava da ovi međuvrsni makroevolucijski obrasci mogu biti uglavnom vođeni promjenama u percepciji i odgovoru unutrašnjih hormona.
Pored interakcije između biljaka i biljojeda, istraživanje metaboličke raznolikosti povezano je sa svim važnim teorijskim napretkom u istraživanju biološke adaptacije na okolinu i evolucije složenih fenotipskih osobina. S povećanjem količine podataka prikupljenih modernim MS instrumentima, testiranje hipoteza o metaboličkoj raznolikosti sada može prevazići individualne/kategorijske razlike u metabolitima i izvršiti globalnu analizu kako bi se otkrili neočekivani obrasci. U procesu analize velikih razmjera, važna metafora je ideja o osmišljavanju značajnih mapa koje se mogu koristiti za istraživanje podataka. Stoga je važan rezultat trenutne kombinacije nepristrasne MS/MS metabolomike i teorije informacija to što pruža jednostavnu metriku koja se može koristiti za konstrukciju mapa za pregledavanje metaboličke raznolikosti na različitim taksonomskim skalama. To je osnovni zahtjev ove metode. Proučavanje mikro/makro evolucije i ekologije zajednice.
Na makroevolucijskom nivou, srž teorije koevolucije biljaka i insekata Ehrlicha i Ravena (51) je predviđanje da je varijacija međuvrsne metaboličke raznolikosti uzrok diverzifikacije biljnih loza. Međutim, u pedeset godina od objavljivanja ovog seminalnog rada, ova hipoteza je rijetko testirana (52). To je uglavnom zbog filogenetskih karakteristika uporedivih metaboličkih karakteristika u biljnim lozama na velike udaljenosti. Rijetkost se može koristiti za sidrenje metoda analize ciljeva. Trenutni MS/MS tok rada obrađen teorijom informacija kvantificira strukturnu sličnost MS/MS nepoznatih metabolita (bez prethodne selekcije metabolita) i pretvara ove MS/MS u skup MS/MS, tako da se u profesionalnom metabolizmu ovi makroevolucijski modeli porede u klasifikacijskoj skali. Jednostavni statistički indikatori. Proces je sličan filogenetskoj analizi, koja može koristiti poravnanje sekvenci za kvantifikaciju stope diverzifikacije ili evolucije karaktera bez prethodnog predviđanja.
Na biohemijskom nivou, hipoteza skrininga Firna i Jonesa (53) pokazuje da se metabolička raznolikost održava na različitim nivoima kako bi se obezbijedile sirovine za vršenje bioloških aktivnosti prethodno nepovezanih ili supstituisanih metabolita. Metode teorije informacija pružaju okvir u kojem se ovi evolucioni prelazi specifični za metabolite koji se javljaju tokom specijalizacije metabolita mogu kvantificirati kao dio predloženog evolucijskog procesa skrininga: biološki aktivna adaptacija od niske specifičnosti do visoke specifičnosti. Inhibirani metaboliti datog okruženja.
Sve u svemu, u ranim danima molekularne biologije razvijene su važne teorije odbrane biljaka, a deduktivne metode zasnovane na hipotezama se široko smatraju jedinim sredstvom naučnog napretka. To je uglavnom zbog tehničkih ograničenja mjerenja cijelog metaboloma. Iako su metode zasnovane na hipotezama posebno korisne u odabiru drugih uzročnih mehanizama, njihova sposobnost da unaprijede naše razumijevanje biohemijskih mreža je ograničenija od računarskih metoda koje su trenutno dostupne u savremenoj nauci koja intenzivno koristi podatke. Stoga, teorije koje se ne mogu predvidjeti daleko prevazilaze opseg dostupnih podataka, tako da se hipotetička formula/testni ciklus napretka u istraživačkom polju ne može ukinuti (4). Predviđamo da računarski tok rada metabolomike predstavljen ovdje može ponovo probuditi interes za nedavna (kako) i konačna (zašto) pitanja metaboličke raznolikosti i doprinijeti novoj eri teoretski vođene nauke o podacima. Era je preispitala važne teorije koje su inspirisale prethodne generacije.
Direktno hranjenje biljojeda vrši se uzgojem larve drugog stadija ili Sl larve na jednom listu blijedoobojene biljke vrča jedne biljke u cvatu ruže, sa 10 biljnih replikata po biljci. Larve insekata su stegnute stezaljkama, a preostalo tkivo lista je sakupljeno 24 i 72 sata nakon infekcije i brzo zamrznuto, a metaboliti su ekstrahovani.
Simulirajte tretman biljojeda na visoko sinhronizovan način. Metoda se sastoji u korištenju točkova sa tkaninskim uzorkom za probijanje tri reda trnja sa svake strane srednjeg rebra tri potpuno razvijena lista biljke tokom faze rasta tkaninskog vijenca, te odmah nanošenjem razrijeđenog Ms u omjeru 1:5. Ili upotrebom rukavica za umetanje S1 OS u ubodnu ranu. Uberite i obradite list kao što je gore opisano. Koristite prethodno opisanu metodu za ekstrakciju primarnih metabolita i biljnih hormona (54).
Za egzogene JA primjene, tri peteljka lista svake od šest biljaka ruža u cvatu svake vrste tretiraju se s 20 μl lanolin paste koja sadrži 150 μg MeJA (Lan + MeJA) i 20 μl lanolina plus tretman za rane (Lan + W), ili se koristi 20 μl čistog lanolina kao kontrola. Listovi su ubrani 72 sata nakon tretmana, brzo zamrznuti u tekućem dušiku i pohranjeni na -80°C do upotrebe.
U našoj istraživačkoj grupi identifikovane su četiri transgene linije JA i ET, i to irAOC (36), irCOI1 (55), irACO i sETR1 (48). irAOC je pokazao snažno smanjenje nivoa JA i JA-Ile, dok irCOI1 nije bio osjetljiv na JA. U poređenju sa EV, akumulacija JA-Ile se povećala. Slično tome, irACO će smanjiti proizvodnju ET, a u poređenju sa EV, sETR1, koji je neosjetljiv na ET, će povećati proizvodnju ET.
Za neinvazivno mjerenje ET-a koristi se fotoakustični laserski spektrometar (Sensor Sense ETD-300 senzor ET u realnom vremenu). Odmah nakon tretmana, polovina listova je prerezana i prebačena u zatvorenu staklenu bočicu od 4 ml, a prostor iznad tekućine je ostavljen da se akumulira u roku od 5 sati. Tokom mjerenja, svaka bočica je isprana mlazom čistog zraka od 2 litre/sat tokom 8 minuta, koji je prethodno prošao kroz katalizator koji je osigurao Sensor Sense radi uklanjanja CO2 i vode.
Podaci mikročipa su prvobitno objavljeni u (35) i sačuvani u Sveobuhvatnoj bazi podataka o ekspresiji gena Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) (pristupni broj GSE30287). Podaci koji odgovaraju listovima uzrokovanim tretmanom W + OSM i neoštećenoj kontroli su izdvojeni za ovu studiju. Sirovi intenzitet je log2. Prije statističke analize, osnovna linija je konvertovana i normalizovana na svoj 75. percentil korištenjem R softverskog paketa.
Originalni podaci sekvenciranja RNK (RNA-seq) vrsta Nicotiana preuzeti su iz NCBI arhive kratkih čitanja (SRA), broj projekta je PRJNA301787, o čemu su izvijestili Zhou i saradnici (39), a postupak je opisan u (56). Sirovi podaci obrađeni pomoću W + W, W + OSM i W + OSS1 koji odgovaraju vrstama Nicotiana odabrani su za analizu u ovoj studiji i obrađeni na sljedeći način: Prvo, sirovi podaci sekvenciranja RNK pretvoreni su u FASTQ format. HISAT2 pretvara FASTQ u SAM, a SAMtools pretvara SAM datoteke u sortirane BAM datoteke. StringTie se koristi za izračunavanje ekspresije gena, a njegova metoda ekspresije je da postoje fragmenti na hiljadu baznih fragmenata na milion sekvenciranih transkripcijskih fragmenata.
Acclaim hromatografska kolona (150 mm x 2,1 mm; veličina čestica 2,2 μm) korištena u analizi i zaštitna kolona 4 mm x 4 mm izrađene su od istog materijala. Sljedeći binarni gradijent koristi se u Dionex UltiMate 3000 sistemu tečne hromatografije ultra visokih performansi (UHPLC): 0 do 0,5 minuta, izokratski 90% A [deionizirana voda, 0,1% (v/v) acetonitril i 0,05% mravlja kiselina], 10% B (acetonitril i 0,05% mravlja kiselina); 0,5 do 23,5 minuta, gradijentna faza je 10% A i 90% B, respektivno; 23,5 do 25 minuta, izokratski 10% A i 90% B. Brzina protoka je 400 μl/min. Za sve MS analize, ubrizgajte eluent kolone u kvadrupolni i vremenski-proletni (qTOF) analizator opremljen izvorom elektrospreja koji radi u režimu pozitivne jonizacije (napon kapile, 4500 V; izlaz kapile 130 V; temperatura sušenja 200°C; protok zraka za sušenje 10 litara/min).
Izvršite MS/MS analizu fragmenata (u daljnjem tekstu MS/MS) koji su irelevantni ili se ne mogu razlikovati od podataka kako biste dobili strukturne informacije o ukupnom detektabilnom metaboličkom profilu. Koncept neselektivne MS/MS metode oslanja se na činjenicu da kvadrupol ima vrlo veliki prozor izolacije mase [stoga, sve signale odnosa mase i naboja (m/z) smatrajte fragmentima]. Iz tog razloga, budući da instrument Impact II nije bio u stanju stvoriti CE nagib, izvršeno je nekoliko nezavisnih analiza korištenjem povećanih vrijednosti energije disocijacije sudara (CE) izazvane sudarima. Ukratko, prvo analizirajte uzorak UHPLC-elektrosprejnom ionizacijom/qTOF-MS korištenjem načina rada jedne masene spektrometrije (uslovi niske fragmentacije generisani fragmentacijom u izvoru), skenirajući od m/z 50 do 1500 na frekvenciji ponavljanja od 5 Hz. Koristite dušik kao kolizijski plin za MS/MS analizu i izvršite nezavisna mjerenja na sljedeća četiri različita napona disocijacije izazvane sudarima: 20, 30, 40 i 50 eV. Tokom procesa mjerenja, kvadrupol ima najveći prozor izolacije mase, od m/z 50 do 1500. Kada je eksperiment m/z prednjeg tijela i širine izolacije postavljen na 200, raspon mase se automatski aktivira pomoću operativnog softvera instrumenta i 0 Da. Skenirajte za fragmente mase kao u režimu jedne mase. Koristite natrijum format (50 ml izopropanola, 200 μl mravlje kiseline i 1 ml 1M vodenog rastvora NaOH) za kalibraciju mase. Koristeći Brukerov algoritam za kalibraciju visoke preciznosti, datoteka podataka se kalibrira nakon pokretanja prosječnog spektra u datom vremenskom periodu. Koristite funkciju izvoza softvera Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Njemačka) za pretvaranje sirovih datoteka podataka u NetCDF format. Skup podataka MS/MS sačuvan je u otvorenoj metabolomskoj bazi podataka MetaboLights (www.ebi.ac.uk) s pristupnim brojem MTBLS1471.
MS/MS asembliranje se može realizovati putem analize korelacije između MS1 i MS/MS signala kvaliteta za nisku i visoku energiju sudara i novo implementiranih pravila. R skripta se koristi za realizaciju analize korelacije distribucije prekursora do proizvoda, a C# skripta (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) se koristi za implementaciju pravila.
Kako bismo smanjili lažno pozitivne greške uzrokovane pozadinskom bukom i lažnom korelacijom uzrokovanom detekcijom određenih m/z karakteristika u samo nekoliko uzoraka, koristimo funkciju "popunjenog vrha" iz R paketa XCMS (za korekciju pozadinske buke). Treba je koristiti za zamjenu intenziteta "NA" (nedetektovanog vrha). Kada se koristi funkcija popunjenog vrha, u skupu podataka i dalje postoji mnogo vrijednosti intenziteta "0" koje će utjecati na izračun korelacije. Zatim upoređujemo rezultate obrade podataka dobivene kada se koristi funkcija popunjenog vrha i kada se funkcija popunjenog vrha ne koristi, te izračunavamo vrijednost pozadinske buke na osnovu prosječne korigirane procijenjene vrijednosti, a zatim zamjenjujemo ove vrijednosti intenziteta od 0 izračunatom pozadinskom vrijednošću. Također smo uzeli u obzir samo karakteristike čiji je intenzitet tri puta veći od pozadinske vrijednosti i smatrali ih "pravim vrhovima". Za PCC izračune, uzimaju se u obzir samo m/z signali prethodnika uzorka (MS1) i fragmenta sa najmanje osam pravih vrhova.
Ako je intenzitet karakteristike kvalitete prekursora u cijelom uzorku značajno koreliran sa smanjenim intenzitetom iste karakteristike kvalitete koja je podvrgnuta niskoj ili visokoj energiji sudara, a karakteristika nije označena kao izotopski vrh od strane CAMERA programa, ona se može dalje definirati. Zatim se, izračunavanjem svih mogućih parova prekursor-produkt unutar 3 s (procijenjeni vremenski prozor zadržavanja za zadržavanje vrha), provodi analiza korelacije. Samo kada je vrijednost m/z niža od vrijednosti prekursora i MS/MS fragmentacija se dogodi na istoj lokaciji uzorka u skupu podataka kao i prekursor iz kojeg je izvedena, smatra se fragmentom.
Na osnovu ova dva jednostavna pravila, isključujemo određene fragmente sa m/z vrijednostima većim od m/z identifikovanog prekursora, i na osnovu pozicije uzorka gdje se prekursor pojavljuje i određenog fragmenta. Također je moguće odabrati karakteristike kvaliteta generisane mnogim fragmentima u izvoru generisanim u MS1 ​​modu kao kandidate za prekursore, čime se generišu redundantni MS/MS spojevi. Kako bismo smanjili ovu redundantnost podataka, ako NDP sličnost spektara prelazi 0,6, a oni pripadaju hromatogramu "pcgroup" označenom od strane CAMERA, spojit ćemo ih. Konačno, spajamo sva četiri CE rezultata povezana sa prekursorom i fragmentima u konačni dekonvoluirani kompozitni spektar odabirom vrha najvećeg intenziteta među svim kandidatima za vrhove sa istom m/z vrijednošću pri različitim energijama sudara. Naknadni koraci obrade zasnivaju se na konceptu kompozitnog spektra i uzimaju u obzir različite CE uslove potrebne za maksimiziranje vjerovatnoće fragmentacije, jer se neki fragmenti mogu detektovati samo pod određenom energijom sudara.
RDPI (30) je korišten za izračunavanje inducibilnosti metaboličkog profila. Raznolikost metaboličkog spektra (Hj indeks) izvedena je iz obilja MS/MS prekursora korištenjem Shannon entropije MS/MS frekvencijske distribucije, koristeći sljedeću jednačinu koju su opisali Martínez i saradnici (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) gdje Pij odgovara relativnoj frekvenciji i-tog MS/MS u j-tom uzorku (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Metabolička specifičnost (Si indeks) definirana je kao identitet ekspresije datog MS/MS u odnosu na frekvenciju između razmatranih uzoraka. Specifičnost MS/MS izračunava se kao Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Koristite sljedeću formulu za mjerenje metabolom-specifičnog δj indeksa svakog j-tog uzorka i prosjeka MS/MS specifičnosti δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS spektri su poravnati u parovima, a sličnost se izračunava na osnovu dva rezultata. Prvo, koristeći standardni NDP (također poznat kao metoda kosinusne korelacije), koristite sljedeću jednačinu za bodovanje sličnosti segmenata između spektara NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 gdje S1 i S2 Odnosno, za spektar 1 i spektar 2, kao i WS1, i i WS2, i predstavlja težinu na osnovu intenziteta vrha, gdje je razlika i-tog zajedničkog vrha između dva spektra manja od 0,01 Da. Težina se izračunava na sljedeći način: W = [intenzitet vrha] m [kvalitet] n, m = 0,5, n = 2, kako je predložio MassBank.
Implementirana je druga metoda bodovanja, koja je uključivala analizu dijeljenog NL između MS/MS. U tu svrhu, koristili smo 52 NL liste koje se često susreću tokom procesa fragmentacije MS zajedno, i specifičniji NL (datoteka podataka S1) koji je prethodno označen za MS/MS spektar sekundarnih metabolita oslabljene vrste Nepenthes (9, 26). Kreirajte binarni vektor od 1 i 0 za svaki MS/MS, koji odgovara trenutnom i nepostojećem nekom NL-u. Na osnovu sličnosti euklidske udaljenosti, rezultat sličnosti NL-a izračunava se za svaki par binarnih NL vektora.
Za izvođenje dvostrukog klasteriranja koristili smo R paket DiffCoEx, koji se zasniva na proširenju analize ponderirane genske koekspresije (WGCNA). Koristeći NDP i NL matrice bodovanja MS/MS spektara, koristili smo DiffCoEx za izračunavanje komparativne matrice korelacije. Binarno klasteriranje se vrši postavljanjem parametra „cutreeDynamic“ na method = „hybrid“, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T i minClusterSize = 10. R izvorni kod DiffCoEx-a preuzet je iz dodatne datoteke 1 od strane Tessona i saradnika (57); Potreban R WGCNA softverski paket može se naći na https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Kako bismo izvršili MS/MS molekularnu analizu mreže, izračunali smo uparenu spektralnu povezanost na osnovu tipova sličnosti NDP i NL, te koristili Cytoscape softver za vizualizaciju topologije mreže korištenjem organskog rasporeda u aplikaciji za proširenje algoritma rasporeda CyFilescape yFiles.
Za statističku analizu podataka upotrijebite R verziju 3.0.1. Statistička značajnost procijenjena je dvosmjernom analizom varijanse (ANOVA), nakon čega je uslijedio Tukeyjev post-hoc test značajne razlike (HSD). Kako bi se analizirala razlika između tretmana biljojeda i kontrole, analizirana je dvostrana distribucija dvije grupe uzoraka s istom varijansom pomoću Studentovog t-testa.
Za dodatne materijale za ovaj članak, pogledajte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod uslovima Creative Commons licence Attribution-Non-Commercial, koja dozvoljava korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, sve dok konačna upotreba nije u komercijalne svrhe i pretpostavka je da je originalno djelo ispravno. Referenca.
Napomena: Molimo vas da navedete svoju email adresu samo kako bi osoba koju preporučite stranici znala da želite da vidi email i da se ne radi o neželjenoj pošti. Nećemo prikupljati email adrese.
Ovo pitanje se koristi za provjeru da li ste posjetilac i sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
Teorija informacija pruža univerzalnu valutu za poređenje specijalnih metaboloma i predviđanje teorija odbrane od testiranja.
Teorija informacija pruža univerzalnu valutu za poređenje specijalnih metaboloma i predviđanje teorija odbrane od testiranja.
©2021 Američko udruženje za unapređenje nauke. sva prava pridržana. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.