Članak je dio istraživačke teme „Poboljšanje otpornosti mahunarki na patogene i štetočine“, pogledajte svih 5 članaka
Uzročnik gljivične bolesti nekroze biljaka, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, koristi višeslojnu strategiju za inficiranje različitih biljaka domaćina. Ova studija predlaže upotrebu diamina L-ornitina, neproteinske aminokiseline koja stimulira sintezu drugih esencijalnih aminokiselina, kao alternativnu strategiju upravljanja za poboljšanje molekularnih, fizioloških i biohemijskih odgovora Phaseolus vulgaris L. na bijelu plijesan uzrokovanu Pseudomonas sclerotiorum. In vitro eksperimenti su pokazali da L-ornitin značajno inhibira rast micelija S. pyrenoidosa na način koji zavisi od doze. Štaviše, mogao bi značajno smanjiti ozbiljnost bijele plijesni u uslovima staklenika. Nadalje, L-ornitin je stimulirao rast tretiranih biljaka, što ukazuje da testirane koncentracije L-ornitina nisu bile fitotoksične za tretirane biljke. Osim toga, L-ornitin je pojačao ekspresiju neenzimskih antioksidanata (ukupni rastvorljivi fenoli i flavonoidi) i enzimskih antioksidanata (katalaza (CAT), peroksidaza (POX) i polifenol oksidaza (PPO)), te povećao ekspresiju tri gena povezana s antioksidansima (PvCAT1, PvSOD i PvGR). Nadalje, in silico analiza otkrila je prisustvo pretpostavljenog proteina oksaloacetat acetilhidrolaze (SsOAH) u genomu S. sclerotiorum, koji je bio vrlo sličan proteinima oksaloacetat acetilhidrolaze (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) i Penicillium sp. (PlOAH) u smislu funkcionalne analize, konzerviranih domena i topologije. Zanimljivo je da je dodavanje L-ornitina u medij od krompirove dekstroze (PDB) značajno smanjilo ekspresiju gena SsOAH u miceliju S. sclerotiorum. Slično tome, egzogena primjena L-ornitina značajno je smanjila ekspresiju SsOAH gena u gljivičnom miceliju prikupljenom iz tretiranih biljaka. Konačno, primjena L-ornitina značajno je smanjila lučenje oksalne kiseline i u PDB mediju i u zaraženom lišću. Zaključno, L-ornitin igra ključnu ulogu u održavanju redoks statusa, kao i u poboljšanju odbrambenog odgovora zaraženih biljaka. Rezultati ove studije mogu pomoći u razvoju inovativnih, ekološki prihvatljivih metoda za kontrolu bijele plijesni i ublažavanje njenog utjecaja na proizvodnju graha i drugih usjeva.
Bijela plijesan, koju uzrokuje nekrotrofna gljivica Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, je razorna bolest koja smanjuje prinos i predstavlja ozbiljnu prijetnju globalnoj proizvodnji graha (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum je jedan od najtežih za suzbijanje gljivičnih biljnih patogena koji se prenose zemljištem, sa širokim rasponom domaćina od preko 600 biljnih vrsta i sposobnošću brze maceracije tkiva domaćina na nespecifičan način (Liang i Rollins, 2018). U nepovoljnim uslovima, prolazi kroz kritičnu fazu svog životnog ciklusa, ostajući mirujuća duži vremenski period kao crne, tvrde, sjemenkama slične strukture zvane 'sklerocije' u tlu ili kao bijele, pahuljaste izrasline u miceliju ili srži stabljike zaraženih biljaka (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum je sposoban za formiranje sklerocija, što mu omogućava da preživi na zaraženim poljima duži vremenski period i da opstane tokom bolesti (Schwartz et al., 2005). Sklerocije su bogate hranjivim tvarima, mogu opstati u tlu duži vremenski period i služe kao primarni inokulum za naknadne infekcije (Schwartz et al., 2005). Pod povoljnim uslovima, sklerocije klijaju i proizvode spore koje se prenose zrakom i mogu zaraziti sve nadzemne dijelove biljke, uključujući, ali ne ograničavajući se na cvjetove, stabljike ili mahune (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum koristi višeslojnu strategiju za inficiranje biljaka domaćina, koja uključuje niz koordiniranih događaja, od klijanja sklerocija do razvoja simptoma. U početku, S. sclerotiorum proizvodi suspendovane spore (nazvane askospore) iz struktura sličnih gljivama koje se nazivaju apotecije, koje se prenose zrakom i razvijaju u nepokretne sklerocije na zaraženim biljnim ostacima (Bolton et al., 2006). Gljivica zatim luči oksalnu kiselinu, faktor virulencije, kako bi kontrolirala pH ćelijskog zida biljke, potaknula enzimsku razgradnju i invaziju tkiva (Hegedus i Rimmer, 2005) te suzbila oksidativni nalet biljke domaćina. Ovaj proces zakiseljavanja slabi ćelijski zid biljke, pružajući povoljno okruženje za normalan i efikasan rad enzima koji razgrađuju ćelijski zid gljivica (CWDE), omogućavajući patogenu da savlada fizičku barijeru i prodre u tkiva domaćina (Marciano et al., 1983). Nakon prodiranja, S. sclerotiorum luči brojne CWDE-e, kao što su poligalakturonaza i celulaza, koji olakšavaju njegovo širenje u zaraženim tkivima i uzrokuju nekrozu tkiva. Progresija lezija i hifalnih podloga dovodi do karakterističnih simptoma bijele plijesni (Hegedus i Rimmer, 2005). U međuvremenu, biljke domaćini prepoznaju molekularne obrasce povezane s patogenima (PAMP) putem receptora za prepoznavanje obrazaca (PRR), pokrećući niz signalnih događaja koji u konačnici aktiviraju obrambene odgovore.
Uprkos decenijama napora u kontroli bolesti, i dalje postoji nedostatak adekvatne rezistentne germplazme kod pasulja, kao i kod drugih komercijalnih usjeva, zbog otpornosti, preživljavanja i prilagodljivosti patogena. Suzbijanje bolesti je stoga izuzetno izazovno i zahtijeva integriranu, višestruku strategiju koja uključuje kombinaciju agrotehničkih praksi, biološke kontrole i hemijskih fungicida (O'Sullivan et al., 2021). Hemijska kontrola bijele plijesni je najefikasnija jer fungicidi, kada se primjenjuju pravilno i u pravo vrijeme, mogu efikasno kontrolirati širenje bolesti, smanjiti težinu infekcije i minimizirati gubitke prinosa. Međutim, prekomjerna upotreba i prekomjerno oslanjanje na fungicide može dovesti do pojave rezistentnih sojeva S. sclerotiorum i negativno utjecati na organizme koji nisu ciljne skupine, zdravlje tla i kvalitet vode (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Stoga je pronalaženje ekološki prihvatljivih alternativa postalo glavni prioritet.
Poliamini (PA), kao što su putrescin, spermidin, spermin i kadaverin, mogu poslužiti kao obećavajuće alternative protiv biljnih patogena koji se prenose zemljištem, čime se potpuno ili djelomično smanjuje upotreba opasnih hemijskih fungicida (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Kod viših biljaka, PA su uključeni u mnoge fiziološke procese, uključujući, ali ne ograničavajući se na, diobu ćelija, diferencijaciju i odgovor na abiotske i biotičke stresove (Killiny i Nehela, 2020). Mogu djelovati kao antioksidansi, pomoći u uklanjanju reaktivnih vrsta kisika (ROS), održavati redoks homeostazu (Nehela i Killiny, 2023), inducirati gene povezane s odbranom (Romero et al., 2018), regulirati različite metaboličke puteve (Nehela i Killiny, 2023), modulirati endogene fitohormone (Nehela i Killiny, 2019), uspostaviti sistemsku stečenu otpornost (SAR) i regulirati interakcije biljaka i patogena (Nehela i Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Vrijedi napomenuti da specifični mehanizmi i uloge PA u odbrani biljaka variraju ovisno o biljnoj vrsti, patogenima i uvjetima okoline. Najzastupljenija PA u biljkama biosintetizira se iz esencijalnog poliamina L-ornitina (Killiny i Nehela, 2020).
L-ornitin igra višestruke uloge u rastu i razvoju biljaka. Na primjer, prethodne studije su pokazale da kod riže (Oryza sativa), ornitin može biti povezan s recikliranjem dušika (Liu et al., 2018), prinosom, kvalitetom i aromom riže (Lu et al., 2020), te odgovorom na vodni stres (Yang et al., 2000). Nadalje, egzogena primjena L-ornitina značajno je poboljšala toleranciju na sušu kod šećerne repe (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) i ublažila stres od soli kod biljaka luka (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu i Çavuşoǧlu, 2021) i indijskog oraha (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Potencijalna uloga L-ornitina u odbrani od abiotičkog stresa može biti posljedica njegovog učešća u akumulaciji prolina u tretiranim biljkama. Na primjer, ranije je objavljeno da su geni povezani s metabolizmom prolina, kao što su geni ornitin delta aminotransferaze (delta-OAT) i prolin dehidrogenaze (ProDH1 i ProDH2), uključeni u odbranu Nicotiana benthamiana i Arabidopsis thaliana od sojeva Pseudomonas syringae koji nisu domaćini (Senthil-Kumar i Mysore, 2012). S druge strane, gljivična ornitin dekarboksilaza (ODC) je neophodna za rast patogena (Singh et al., 2020). Ciljano djelovanje na ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici putem utišavanja gena induciranog od strane domaćina (HIGS) značajno je poboljšalo otpornost biljaka paradajza na uvenuće uzrokovano Fusariumom (Singh et al., 2020). Međutim, potencijalna uloga primjene egzogenog ornitina protiv biotičkih stresova poput fitopatogena nije dobro proučena. Što je još važnije, efekti ornitina na otpornost na bolesti i povezane biohemijske i fiziološke pojave ostaju uglavnom neistraženi.
Razumijevanje složenosti infekcije mahunarki uzrokovane S. sclerotiorum važno je za razvoj efikasnih strategija suzbijanja. U ovoj studiji, cilj nam je bio identificirati potencijalnu ulogu diamina L-ornitina kao ključnog faktora u jačanju odbrambenih mehanizama i otpornosti biljaka mahunarki na infekciju Sclerotinia sclerotiorum. Pretpostavljamo da, pored jačanja odbrambenih odgovora zaraženih biljaka, L-ornitin također igra ključnu ulogu u održavanju redoks statusa. Pretpostavljamo da su potencijalni efekti L-ornitina povezani s regulacijom enzimskih i neenzimskih antioksidativnih odbrambenih mehanizama i interferencijom s faktorima patogenosti/virulencije gljivica i povezanim proteinima. Ova dvostruka funkcionalnost L-ornitina čini ga obećavajućim kandidatom za održivu strategiju ublažavanja utjecaja bijele plijesni i poboljšanja otpornosti uobičajenih usjeva mahunarki na ovaj potentni gljivični patogen. Rezultati ove studije mogu pomoći u razvoju inovativnih, ekološki prihvatljivih metoda za suzbijanje bijele plijesni i ublažavanje njenog utjecaja na proizvodnju mahunarki.
U ovoj studiji, osjetljiva komercijalna sorta običnog graha, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), korištena je kao eksperimentalni materijal. Zdravo sjeme ljubazno je ustupio Odjel za istraživanje mahunarki, Institut za istraživanje ratarskih usjeva (FCRI), Poljoprivredni istraživački centar (ARC), Egipat. Pet sjemenki posijano je u plastične saksije (unutrašnji promjer 35 cm, dubina 50 cm) napunjene zemljom zaraženom S. sclerotiorum u uslovima staklenika (25 ± 2 °C, relativna vlažnost 75 ± 1%, 8 sati svjetla/16 sati mraka). 7-10 dana nakon sjetve (DPS), sadnice su prorijeđene tako da su u svakoj saksiji ostale samo dvije sadnice s ujednačenim rastom i tri potpuno razvijena lista. Sve biljke u saksijama zalijevale su se jednom svake dvije sedmice i gnojile mjesečno preporučenom dozom za datu sortu.
Za pripremu L-ornitindiamina (poznatog i kao (+)-(S)-2,5-diaminopentanoična kiselina; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Njemačka) koncentracije od 500 mg/L, 50 mg je prvo rastvoreno u 100 mL sterilne destilovane vode. Osnovni rastvor je zatim razrijeđen i korišten u narednim eksperimentima. Ukratko, šest serija koncentracija L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/L) testirano je in vitro. Pored toga, sterilna destilovana voda je korištena kao negativna kontrola (Mock), a komercijalni fungicid „Rizolex-T“ 50% vlaživi prah (toklofos-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Governorate Gharbia, Egipat) je korišten kao pozitivna kontrola. Komercijalni fungicid „Rizolex-T“ testiran je in vitro u pet koncentracija (2, 4, 6, 8 i 10 mg/L).
Uzorci stabljika i mahuna običnog graha koji pokazuju tipične simptome bijele plijesni (stopa zaraze: 10–30%) prikupljeni su s komercijalnih farmi. Iako je većina zaraženog biljnog materijala identificirana po vrsti/sorti (osjetljiva komercijalna sorta Giza 3), drugi, posebno oni nabavljeni s lokalnih tržišta, bili su nepoznate vrste. Sakupljeni zaraženi materijali prvo su površinski dezinficirani 0,5% otopinom natrijevog hipohlorita tokom 3 minute, zatim nekoliko puta isprani sterilnom destiliranom vodom i obrisani suhim sterilnim filter papirom kako bi se uklonio višak vode. Zaraženi organi su zatim izrezani na male komadiće iz srednjeg tkiva (između zdravog i zaraženog tkiva), kultivirani na podlozi od krompirovog dekstroznog agara (PDA) i inkubirani na 25 ± 2 °C s ciklusom od 12 sati svjetla/12 sati tame tokom 5 dana kako bi se stimuliralo stvaranje sklerocija. Metoda micelijskog vrha također je korištena za pročišćavanje gljivičnih izolata iz mješovitih ili kontaminiranih kultura. Pročišćeni gljivični izolat je prvo identificiran na osnovu svojih kulturnih morfoloških karakteristika, a zatim je potvrđeno da je S. sclerotiorum na osnovu mikroskopskih karakteristika. Konačno, svi pročišćeni izolati su testirani na patogenost na osjetljivoj sorti običnog graha Giza 3 kako bi se ispunili Kochovi postulati.
Osim toga, najinvazivniji izolat S. sclerotiorum (izolat #3) dodatno je potvrđen na osnovu sekvenciranja internog transkribiranog razmaknika (ITS) kako je opisano od strane White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Ukratko, izolati su kultivirani u juhi od krompirove dekstroze (PDB) i inkubirani na 25 ± 2 °C tokom 5-7 dana. Gljivični micelij je zatim sakupljen, filtriran kroz gazu, ispran dva puta sterilnom vodom i osušen sterilnim filter papirom. Genomska DNK je izolovana korištenjem Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit-a (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). ITS rDNK regija je zatim amplificirana korištenjem specifičnog para primera ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; očekivana veličina: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Pročišćeni PCR produkti su poslani na sekvenciranje (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNK sekvence su sekvencirane dvosmjerno korištenjem Sanger metode sekvenciranja. Sastavljene upitne sekvence su zatim upoređene s najnovijim podacima u GenBank i Nacionalnom centru za biotehnološke informacije (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) korištenjem BLASTn softvera. Sekvenca upita je upoređena sa 20 drugih sojeva/izolata S. sclerotiorum preuzetih iz najnovijih podataka u NCBI GenBank (Dodatna tabela S1) korištenjem ClustalW-a u Paketu za molekularnu evolucijsku genetiku (MEGA-11; verzija 11) (Kumar et al., 2024). Evolucijska analiza je izvršena korištenjem metode maksimalne vjerovatnoće i općeg vremenski reverzibilnog modela supstitucije nukleotida (Nei i Kumar, 2000). Prikazano je stablo s najvećom logaritamskom vjerovatnoćom. Početno stablo za heurističku pretragu je odabrano odabirom stabla s većom logaritamskom vjerovatnoćom između stabla spajanja susjeda (NJ) (Kumar et al., 2024) i stabla maksimalne štedljivosti (MP). NJ stablo je konstruisano korištenjem matrice udaljenosti po parovima izračunate korištenjem općeg vremenski reverzibilnog modela (Nei i Kumar, 2000).
Antibakterijska aktivnost L-ornitina i baktericida „Rizolex-T“ određena je in vitro metodom difuzije u agaru. Metoda: Uzeti odgovarajuću količinu osnovnog rastvora L-ornitina (500 mg/L) i dobro je pomiješati sa 10 ml PDA hranjive podloge kako bi se pripremili rastvori s konačnim koncentracijama od 12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/L, respektivno. Pet koncentracija fungicida „Rizolex-T“ (2, 4, 6, 8 i 10 mg/L) i sterilna destilovana voda korišteni su kao kontrola. Nakon što se podloga stvrdnula, svježe pripremljeni micelijski čep kulture Sclerotinia sclerotiorum, promjera 4 mm, prenesen je u središte Petrijeve zdjelice i kultiviran na 25±2°C dok micelij nije prekrio cijelu kontrolnu Petrijevu zdjelicu, nakon čega je zabilježen rast gljivica. Izračunajte postotak inhibicije radijalnog rasta S. sclerotiorum koristeći jednačinu 1:
Eksperiment je ponovljen dva puta, sa šest bioloških replikata za svaku kontrolnu/eksperimentalnu grupu i pet saksija (dvije biljke po saksiji) za svaki biološki replikat. Svaki biološki replikat je analiziran dva puta (dva tehnička replikata) kako bi se osigurala tačnost, pouzdanost i ponovljivost eksperimentalnih rezultata. Pored toga, korištena je probit regresijska analiza za izračunavanje polumaksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) i IC99 (Prentice, 1976).
Kako bi se procijenio potencijal L-ornitina u uslovima staklenika, provedena su dva uzastopna eksperimenta u posudama. Ukratko, posude su napunjene sterilizovanom glinovitim pijeskom (3:1) i inokulirane svježe pripremljenom kulturom S. sclerotiorum. Prvo, najinvazivniji izolat S. sclerotiorum (izolat #3) je kultiviran prerezivanjem jednog sklerocija na pola, postavljanjem licem prema dolje na PDA i inkubacijom na 25°C u stalnom mraku (24 sata) tokom 4 dana kako bi se stimulisao rast micelija. Zatim su uzeta četiri agar čepa promjera 5 mm sa prednje ivice i inokulirana sa 100 g sterilne mješavine pšeničnih i rižinih mekinja (1:1, v/v) i sve tikvice su inkubirane na 25 ± 2 °C pod ciklusom od 12 sati svjetla/12 sati mraka tokom 5 dana kako bi se stimulisalo stvaranje sklerocija. Sadržaj svih tikvica je temeljito izmiješan kako bi se osigurala homogenost prije dodavanja zemlje. Zatim je u svaku posudu dodano 100 g mješavine mekinja za kolonizaciju kako bi se osigurala konstantna koncentracija patogena. Inokulirane posude su zalijene kako bi se aktivirao rast gljivica i stavljene u stakleničke uvjete na 7 dana.
U svaku saksiju je zatim posijano pet sjemenki sorte Giza 3. Za saksije tretirane L-ornitinom i fungicidom Rizolex-T, sterilizirano sjeme je prvo natopljeno dva sata u vodenom rastvoru dva jedinjenja sa konačnom IC99 koncentracijom od oko 250 mg/L i 50 mg/L, respektivno, a zatim sušeno na zraku jedan sat prije sjetve. S druge strane, sjeme je natopljeno u sterilnoj destilovanoj vodi kao negativna kontrola. Nakon 10 dana, prije prvog zalijevanja, sadnice su prorijeđene, ostavljajući samo dvije uredne sadnice u svakoj saksiji. Pored toga, kako bi se osigurala infekcija sa S. sclerotiorum, stabljike biljaka pasulja u istoj razvojnoj fazi (10 dana) su prerezane na dva različita mjesta pomoću steriliziranog skalpela i približno 0,5 g kolonizirajuće smjese mekinja je stavljeno u svaku ranu, nakon čega je uslijedila visoka vlažnost kako bi se stimulisala infekcija i razvoj bolesti kod svih inokuliranih biljaka. Kontrolne biljke su slično ozlijeđene i jednaka količina (0,5 g) sterilne, nekolonizirane mješavine mekinja je stavljena u ranu i održavana pod visokom vlažnošću kako bi se simuliralo okruženje za razvoj bolesti i osigurala konzistentnost između tretiranih grupa.
Metoda tretmana: Sadnice graha zalivene su sa 500 ml vodenog rastvora L-ornitina (250 mg/l) ili fungicida Rizolex-T (50 mg/l) navodnjavanjem tla, zatim je tretman ponovljen tri puta u razmaku od 10 dana. Kontrolne grupe tretirane placebom zalivene su sa 500 ml sterilne destilovane vode. Svi tretmani su provedeni u uslovima staklenika (25 ± 2°C, 75 ± 1% relativne vlažnosti i fotoperiod od 8 sati svjetla/16 sati mraka). Sve saksije su zalivene dvonedeljno i tretirane mjesečno uravnoteženim NPK gnojivom (20-20-20, sa 3,6% sumpora i TE mikroelemenata; Zain Seeds, Egipat) u koncentraciji od 3–4 g/l folijarnim prskanjem prema preporukama za specifičnu sortu i uputstvima proizvođača. Osim ako nije drugačije navedeno, potpuno razvijeni zreli listovi (2. i 3. list od vrha) su sakupljeni iz svake biološke replike 72 sata nakon tretmana (hpt), homogenizirani, objedinjeni i pohranjeni na -80 °C za daljnje analize, uključujući, ali ne ograničavajući se na, in situ histohemijsku lokalizaciju indikatora oksidativnog stresa, lipidnu peroksidaciju, enzimske i neenzimske antioksidanse i ekspresiju gena.
Intenzitet infekcije bijelom plijesni procijenjivan je sedmično 21 dan nakon inokulacije (dpi) korištenjem skale od 1 do 9 (Dodatna tabela S2) zasnovane na Petzoldtovoj i Dicksonovoj skali (1996) koju su modificirali Teran i saradnici (2006). Ukratko, stabljike i grane biljaka graha pregledane su počevši od mjesta inokulacije kako bi se pratilo napredovanje lezija duž internodija i čvorova. Zatim je izmjerena udaljenost lezije od mjesta inokulacije do najudaljenije tačke duž stabljike ili grane i dodijeljen je rezultat od 1 do 9 na osnovu lokacije lezije, gdje (1) označava da nema vidljive infekcije u blizini mjesta inokulacije, a (2-9) označava postepeno povećanje veličine lezije i napredovanje duž čvorova/internodija (Dodatna tabela S2). Intenzitet infekcije bijelom plijesni zatim je pretvoren u postotak korištenjem formule 2:
Osim toga, površina ispod krive progresije bolesti (AUDPC) izračunata je korištenjem formule (Shaner i Finney, 1977), koja je nedavno prilagođena za bijelu trulež običnog graha (Chauhan et al., 2020) korištenjem jednačine 3:
Gdje je Yi = težina bolesti u vremenu ti, Yi+1 = težina bolesti u sljedećem vremenu ti+1, ti = vrijeme prvog mjerenja (u danima), ti+1 = vrijeme sljedećeg mjerenja (u danima), n = ukupan broj vremenskih tačaka ili tačaka posmatranja. Parametri rasta biljke pasulja, uključujući visinu biljke (cm), broj grana po biljci i broj listova po biljci, bilježeni su sedmično tokom 21 dana u svim biološkim ponavljanjima.
U svakoj biološkoj replikaciji, uzorci listova (drugi i treći potpuno razvijeni list od vrha) prikupljeni su 45. dana nakon tretmana (15 dana nakon posljednjeg tretmana). Svaka biološka replikacija sastojala se od pet saksija (dvije biljke po saksiji). Oko 500 mg usitnjenog tkiva korišteno je za ekstrakciju fotosintetskih pigmenata (klorofil a, klorofil b i karotenoidi) korištenjem 80% acetona na 4 °C u mraku. Nakon 24 sata, uzorci su centrifugirani, a supernatant je sakupljen za kolorimetrijsko određivanje sadržaja klorofila a, klorofila b i karotenoida korištenjem UV-160A spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japan) prema metodi (Lichtenthaler, 1987) mjerenjem apsorbancije na tri različite talasne dužine (A470, A646 i A663 nm). Konačno, sadržaj fotosintetskih pigmenata izračunat je korištenjem sljedećih formula 4–6 koje je opisao Lichtenthaler (1987).
Nakon 72 sata od tretmana (hpt), listovi (drugi i treći potpuno razvijeni list od vrha) su sakupljeni iz svake biološke replike za in situ histohemijsku lokalizaciju vodikovog peroksida (H2O2) i superoksidnog aniona (O2•−). Svaka biološka replika sastojala se od pet saksija (dvije biljke po saksiji). Svaka biološka replika je analizirana u duplikatu (dva tehnička ponavljanja) kako bi se osigurala tačnost, pouzdanost i ponovljivost metode. H2O2 i O2•− su određeni korištenjem 0,1% 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Njemačka) ili nitroplavog tetrazolijuma (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Njemačka), respektivno, slijedeći metode koje su opisali Romero-Puertas i sar. (2004) i Adam i sar. (1989) uz manje izmjene. Za histohemijsku lokalizaciju H2O2 in situ, listići su vakuumski infiltrirani sa 0,1% DAB u 10 mM Tris puferu (pH 7,8), a zatim inkubirani na sobnoj temperaturi na svjetlu 60 minuta. Listići su izbijeljeni u 0,15% (v/v) TCA u 4:1 (v/v) etanol:hloroformu (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egipat), a zatim izloženi svjetlu dok nisu potamnili. Slično tome, ventili su vakuumski infiltrirani sa 10 mM kalijum fosfatnim puferom (pH 7,8) koji sadrži 0,1 w/v % HBT za histohemijsku lokalizaciju O2•− in situ. Listići su inkubirani na svjetlu na sobnoj temperaturi 20 minuta, zatim izbijeljeni kao gore, a zatim osvijetljeni dok se nisu pojavile tamnoplave/ljubičaste mrlje. Intenzitet rezultirajuće smeđe (kao H2O2 indikator) ili plavo-ljubičaste (kao O2•− indikator) boje procijenjen je korištenjem Fiji verzije paketa za obradu slika ImageJ (http://fiji.sc; pristupljeno 7. marta 2024.).
Malondialdehid (MDA; kao marker lipidne peroksidacije) određen je prema metodi Du i Bramlage (1992) s malim modifikacijama. Listovi iz svake biološke replike (drugi i treći potpuno razvijeni list od vrha) sakupljeni su 72 sata nakon tretmana (hpt). Svaka biološka replika uključivala je pet saksija (dvije biljke po saksiji). Svaka biološka replika analizirana je u duplikatu (dva tehnička ponavljanja) kako bi se osigurala tačnost, pouzdanost i ponovljivost metode. Ukratko, 0,5 g mljevenog tkiva lista korišteno je za ekstrakciju MDA sa 20% trihlorosirćetnom kiselinom (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, SAD) koja sadrži 0,01% butiliranog hidroksitoluena (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). Sadržaj MDA u supernatantu zatim je određen kolorimetrijski mjerenjem apsorbancije na 532 i 600 nm pomoću UV-160A spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japan) i zatim izražen kao nmol g−1 FW.
Za procjenu neenzimskih i enzimskih antioksidanata, listovi (drugi i treći potpuno razvijeni list od vrha) su sakupljeni iz svake biološke replike 72 sata nakon tretmana (hpt). Svaka biološka replika se sastojala od pet saksija (dvije biljke po saksiji). Svaki biološki uzorak je analiziran u duplikatu (dva tehnička uzorka). Dva lista su samljevena tekućim dušikom i direktno korištena za određivanje enzimskih i neenzimskih antioksidanata, ukupnih aminokiselina, sadržaja prolina, ekspresije gena i kvantifikacije oksalata.
Ukupni rastvorljivi fenoli određeni su korištenjem Folin-Ciocalteu reagensa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) s malim modifikacijama metode koju su opisali Kahkonen i saradnici (1999). Ukratko, približno 0,1 g homogeniziranog tkiva lista ekstrahirano je sa 20 ml 80% metanola u mraku tokom 24 sata, a supernatant je sakupljen nakon centrifugiranja. 0,1 ml ekstrakta uzorka pomiješano je sa 0,5 ml Folin-Ciocalteu reagensa (10%), protreseno 30 sekundi i ostavljeno u mraku 5 minuta. Zatim je u svaku epruvetu dodano 0,5 ml 20% rastvora natrijum karbonata (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Egipat), dobro promiješano i inkubirano na sobnoj temperaturi u mraku tokom 1 sata. Nakon inkubacije, apsorbancija reakcijske smjese izmjerena je na 765 nm korištenjem UV-160A spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japan). Koncentracija ukupnih rastvorljivih fenola u ekstraktima uzoraka određena je korištenjem kalibracijske krive galne kiseline (Fisher Scientific, Hampton, NH, SAD) i izražena kao miligrami ekvivalenta galne kiseline po gramu svježe težine (mg GAE g-1 svježe težine).
Ukupni sadržaj rastvorljivih flavonoida određen je prema metodi Djeridanea i saradnika (2006) uz male modifikacije. Ukratko, 0,3 ml gore navedenog metanolnog ekstrakta pomiješano je sa 0,3 ml 5% rastvora aluminijum hlorida (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, SAD), snažno miješano i zatim inkubirano na sobnoj temperaturi 5 minuta, nakon čega je dodano 0,3 ml 10% rastvora kalijum acetata (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egipat), dobro promiješano i inkubirano na sobnoj temperaturi 30 minuta u mraku. Nakon inkubacije, apsorbancija reakcijske smjese izmjerena je na 430 nm pomoću UV-160A spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japan). Koncentracija ukupnih rastvorljivih flavonoida u ekstraktima uzoraka određena je pomoću kalibracijske krive rutina (TCI America, Portland, OR, SAD), a zatim izražena kao miligrami ekvivalenta rutina po gramu svježe težine (mg RE g-1 svježe težine).
Ukupni sadržaj slobodnih aminokiselina u listovima graha određen je korištenjem modificiranog ninhidrinskog reagensa (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SAD) na osnovu metode koju su predložili Yokoyama i Hiramatsu (2003) i modificirali Sun i sar. (2006). Ukratko, 0,1 g mljevenog tkiva ekstrahirano je puferom pH 5,4, a 200 μL supernatanta reagiralo je sa 200 μL ninhidrina (2%) i 200 μL piridina (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, SAD), inkubirano u kipućoj vodenoj kupelji 30 minuta, zatim ohlađeno i izmjereno na 580 nm korištenjem UV-160A spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japan). S druge strane, prolin je određen Batesovom metodom (Bates i sar., 1973). Prolin je ekstrahovan sa 3% sulfosalicilnom kiselinom (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SAD) i nakon centrifugiranja, 0,5 ml supernatanta je pomiješano sa 1 ml glacijalne sirćetne kiseline (Fisher Scientific, Hampton, NH, SAD) i ninhidrinskim reagensom, inkubirano na 90°C tokom 45 minuta, ohlađeno i izmjereno na 520 nm korištenjem istog spektrofotometra kao gore. Ukupne slobodne aminokiseline i prolin u ekstraktima listova određeni su korištenjem kalibracijskih krivulja glicina i prolina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SAD), respektivno, i izraženi kao mg/g svježe težine.
Da bi se odredila enzimska aktivnost antioksidativnih enzima, približno 500 mg homogeniziranog tkiva ekstrahirano je sa 3 ml 50 mM Tris pufera (pH 7,8) koji sadrži 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i 7,5% polivinilpirolidona (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD), centrifugirano na 10.000 × g tokom 20 minuta u frižideru (4 °C), a supernatant (sirovi ekstrakt enzima) je sakupljen (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalaza (CAT) je zatim reagirala sa 2 ml 0,1 M natrijum fosfatnog pufera (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i 100 μl 269 mM rastvora H2O2 kako bi se odredila njena enzimska aktivnost prema metodi Aebija (1984) sa malim modifikacijama (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Enzimska aktivnost gvajakol-zavisne peroksidaze (POX) određena je korištenjem metode Harracha et al. (2009). (2008) s manjim modifikacijama (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) i enzimska aktivnost polifenol oksidaze (PPO) određena je nakon reakcije sa 2,2 ml 100 mM natrijum fosfatnog pufera (pH 6,0), 100 μl gvajakola (TCI chemicals, Portland, OR, SAD) i 100 μl 12 mM H2O2. Metoda je neznatno modificirana u odnosu na (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Test je proveden nakon reakcije sa 3 ml rastvora katehola (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SAD) (0,01 M) svježe pripremljenog u 0,1 M fosfatnom puferu (pH 6,0). Aktivnost CAT-a mjerena je praćenjem razgradnje H2O2 na 240 nm (A240), aktivnost POX-a mjerena je praćenjem povećanja apsorbancije na 436 nm (A436), a aktivnost PPO-a mjerena je bilježenjem fluktuacija apsorbancije na 495 nm (A495) svakih 30 sekundi tokom 3 minute korištenjem UV-160A spektrofotometra (Shimadzu, Japan).
RT-PCR u realnom vremenu korišten je za detekciju nivoa transkripata tri gena povezana s antioksidansima, uključujući peroksizomalnu katalazu (PvCAT1; GenBank pristupni broj KF033307.1), superoksid dismutazu (PvSOD; GenBank pristupni broj XM_068639556.1) i glutation reduktazu (PvGR; GenBank pristupni broj KY195009.1), u listovima graha (drugi i treći potpuno razvijeni list od vrha) 72 sata nakon posljednjeg tretmana. Ukratko, RNK je izolirana korištenjem Simply P Total RNA Extraction Kit-a (kat. br. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Kina) prema protokolu proizvođača. Zatim je cDNA sintetizirana korištenjem TOP script™ cDNA Synthesis Kit-a prema uputama proizvođača. Sekvence primera gore navedena tri gena navedene su u Dodatnoj tabeli S3. PvActin-3 (GenBank pristupni broj: XM_068616709.1) korišten je kao gen za domaćinstvo, a relativna ekspresija gena izračunata je korištenjem 2-ΔΔCT metode (Livak i Schmittgen, 2001). Dokazana je stabilnost aktina pod biotičkim stresom (nekompatibilna interakcija između uobičajenih mahunarki i antraknozne gljive Colletotrichum lindemuthianum) i abiotičkim stresom (suša, salinitet, niska temperatura) (Borges et al., 2012).
U početku smo proveli in silico analizu cijelog genoma proteina oksaloacetat acetilhidrolaze (OAH) u S. sclerotiorum koristeći alat protein-protein BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Ukratko, koristili smo OAH iz Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taksid: 1191702; GenBank pristupni broj XP_040799428.1; 342 aminokiseline) i Penicillium lagena (PlOAH; taksid: 94218; GenBank pristupni broj XP_056833920.1; 316 aminokiselina) kao upitne sekvence za mapiranje homolognog proteina u S. sclerotiorum (taksid: 5180). BLASTp je proveden na najnovijim dostupnim podacima genoma S. sclerotiorum u GenBank-u na web stranici Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Pored toga, predviđeni OAH gen iz S. sclerotiorum (SsOAH) i evolucijska analiza i filogenetsko stablo AfOAH iz A. fijiensis CBS 313.89 i PlOAH iz P. lagena izvedeni su korištenjem metode maksimalne vjerovatnoće u MEGA11 (Tamura et al., 2021) i JTT modela zasnovanog na matrici (Jones et al., 1992). Filogenetsko stablo je kombinovano sa analizom višestrukog poravnanja proteinskih sekvenci svih predviđenih OAH gena (SsOAH) iz S. sclerotiorum i upitne sekvence korištenjem alata za poravnanje zasnovano na ograničenjima (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos i Agarwala, 2007). Osim toga, najbolje podudarne aminokiselinske sekvence SsOAH iz S. sclerotiorum poravnate su sa upitnim sekvencama (AfOAH i PlOAH) (Larkin et al., 2007) korištenjem ClustalW-a (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), a konzervirane regije u poravnanju vizualizirane su korištenjem alata ESPript (verzija 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Nadalje, predviđeni funkcionalni reprezentativni domeni i konzervirana mjesta S. sclerotiorum SsOAH interaktivno su klasificirani u različite porodice korištenjem alata InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Konačno, trodimenzionalno (3D) modeliranje strukture predviđenog S. sclerotiorum SsOAH izvršeno je korištenjem Protein Homology/Analogy Recognition Engine-a (Phyre2 server verzija 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) i validirano korištenjem SWISS-MODEL servera (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Predviđene trodimenzionalne strukture (PDB format) su interaktivno vizualizirane korištenjem UCSF-Chimera paketa (verzija 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Kvantitativna PCR fluorescencija u realnom vremenu korištena je za određivanje transkripcijskog nivoa oksaloacetat acetilhidrolaze (SsOAH; GenBank pristupni broj: XM_001590428.1) u miceliju Sclerotinia sclerotiorum. Ukratko, S. sclerotiorum je inokuliran u tikvicu koja sadrži PDB i stavljen u inkubator na tresilici (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, SAD) na 25 ± 2 °C tokom 24 sata pri 150 rpm i u konstantnom mraku (24 sata) kako bi se stimulirao rast micelija. Nakon toga, ćelije su tretirane L-ornitinom i fungicidom Rizolex-T u konačnim koncentracijama IC50 (približno 40 i 3,2 mg/L, respektivno), a zatim kultivirane još 24 sata pod istim uslovima. Nakon inkubacije, kulture su centrifugirane na 2500 rpm tokom 5 minuta, a supernatant (gljivični micelij) je sakupljen za analizu ekspresije gena. Slično tome, gljivični micelij je sakupljen 0, 24, 48, 72, 96 i 120 sati nakon infekcije iz zaraženih biljaka koje su formirale bijelu plijesan i pamučasti micelij na površini zaraženog tkiva. RNK je ekstrahirana iz gljivičnog micelija, a zatim je cDNA sintetizirana kao što je gore opisano. Sekvence primera za SsOAH navedene su u Dodatnoj tabeli S3. SsActin (GenBank pristupni broj: XM_001589919.1) je korišten kao gen za domaćinstvo, a relativna ekspresija gena izračunata je korištenjem 2-ΔΔCT metode (Livak i Schmittgen, 2001).
Oksalna kiselina je određena u krompirovom dekstroznom bujonu (PDB) i uzorcima biljaka koji sadrže gljivični patogen Sclerotinia sclerotiorum prema metodi Xu i Zhang (2000) s malim modifikacijama. Ukratko, izolati S. sclerotiorum su inokulirani u tikvice koje sadrže PDB, a zatim kultivirani u inkubatoru na tresilici (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, SAD) pri 150 rpm na 25 ± 2 °C tokom 3-5 dana u stalnom mraku (24 h) kako bi se stimulirao rast micelija. Nakon inkubacije, gljivična kultura je prvo filtrirana kroz Whatman #1 filter papir, a zatim centrifugirana pri 2500 rpm tokom 5 minuta kako bi se uklonio preostali micelij. Supernatant je sakupljen i pohranjen na 4°C za daljnje kvantitativno određivanje oksalata. Za pripremu uzoraka biljaka, približno 0,1 g fragmenata biljnog tkiva je ekstrahirano tri puta destiliranom vodom (2 ml svaki put). Uzorci su zatim centrifugirani na 2500 rpm tokom 5 minuta, supernatant je suho filtriran kroz Whatman br. 1 filter papir i sakupljen za daljnju analizu.
Za kvantitativnu analizu oksalne kiseline, reakcijska smjesa je pripremljena u staklenoj epruveti sa čepom sljedećim redoslijedom: 0,2 ml uzorka (ili filtrata PDB kulture ili standardnog rastvora oksalne kiseline), 0,11 ml bromofenol plavog (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, SAD), 0,198 ml 1 M sumporne kiseline (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egipat) i 0,176 ml 100 mM kalijum dihromata (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, SAD), a zatim je rastvor razrijeđen destilovanom vodom na 4,8 ml, snažno promiješan i odmah stavljen u vodeno kupatilo na 60 °C. Nakon 10 minuta, reakcija je zaustavljena dodavanjem 0,5 ml rastvora natrijum hidroksida (NaOH; 0,75 M). Apsorbancija (A600) reakcijske smjese mjerena je na 600 nm pomoću UV-160 spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japan). PDB i destilirana voda korišteni su kao kontrole za kvantifikaciju filtrata kulture, odnosno uzoraka biljaka. Koncentracije oksalne kiseline u filtratima kulture, izražene kao mikrogrami oksalne kiseline po mililitru PDB medija (μg.mL−1), i u ekstraktima listova, izražene kao mikrogrami oksalne kiseline po gramu svježe težine (μg.g−1 FW), određene su pomoću kalibracijske krive oksalne kiseline (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, SAD).
Tokom studije, svi eksperimenti su osmišljeni u potpuno randomiziranom dizajnu (CRD) sa šest bioloških replika po tretmanu i pet saksija po biološkoj repliki (dvije biljke po saksiji), osim ako nije drugačije navedeno. Biološke replike su analizirane u duplikatu (dvije tehničke replike). Tehničke replike su korištene za provjeru ponovljivosti istog eksperimenta, ali nisu korištene u statističkoj analizi kako bi se izbjegli lažni replikati. Podaci su statistički analizirani korištenjem analize varijanse (ANOVA), nakon čega je slijedio Tukey-Kramerov test značajne razlike (HSD) (p ≤ 0,05). Za in vitro eksperimente, vrijednosti IC50 i IC99 su izračunate korištenjem probit modela i izračunati su 95% intervali pouzdanosti.
Ukupno četiri izolata su prikupljena sa različitih polja soje u governoratu El Ghabiya u Egiptu. Na PDA podlozi, svi izolati su proizveli kremasto bijeli micelij koji je brzo postao pamučasto bijel (Slika 1A), a zatim bež ili smeđ u fazi sklerocija. Sklerocije su obično guste, crne, sfernog ili nepravilnog oblika, duge 5,2 do 7,7 mm i promjera 3,4 do 5,3 mm (Slika 1B). Iako su četiri izolata razvila marginalni uzorak sklerocija na rubu podloge za kulturu nakon 10-12 dana inkubacije na 25 ± 2 °C (Slika 1A), broj sklerocija po ploči bio je značajno različit među njima (P < 0,001), pri čemu je izolat 3 imao najveći broj sklerocija (32,33 ± 1,53 sklerocija po ploči; Slika 1C). Slično tome, izolat #3 je proizveo više oksalne kiseline u PDB-u nego drugi izolati (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Slika 1D). Izolat #3 je pokazao tipične morfološke i mikroskopske karakteristike fitopatogene gljivice Sclerotinia sclerotiorum. Na primjer, na PDA, kolonije izolata #3 su brzo rasle, bile su kremasto bijele (Slika 1A), obrnuto bež ili svijetlo losos žuto-smeđe boje, i trebalo im je 6-7 dana na 25 ± 2°C da potpuno prekriju površinu ploče promjera 9 cm. Na osnovu gore navedenih morfoloških i mikroskopskih karakteristika, izolat #3 je identificiran kao Sclerotinia sclerotiorum.
Slika 1. Karakteristike i patogenost izolata S. sclerotiorum iz uobičajenih mahunarki. (A) Rast micelija četiri izolata S. sclerotiorum na PDA podlozi, (B) sklerocije četiri izolata S. sclerotiorum, (C) broj sklerocija (po ploči), (D) lučenje oksalne kiseline na PDB podlozi (μg.mL−1) i (E) težina bolesti (%) četiri izolata S. sclerotiorum na osjetljivoj komercijalnoj mahunarki sorti Giza 3 u uslovima staklenika. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± SD pet bioloških ponavljanja (n = 5). Različita slova označavaju statistički značajne razlike između tretmana (p < 0,05). (F–H) Tipični simptomi bijele plijesni pojavili su se na nadzemnim stabljikama i silicima, respektivno, 10 dana nakon inokulacije izolatom #3 (dpi). (I) Evolucijska analiza regije internog transkribiranog razmaknika (ITS) izolata S. sclerotiorum #3 provedena je korištenjem metode maksimalne vjerovatnoće i upoređena sa 20 referentnih izolata/sojeva dobijenih iz baze podataka Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Brojevi iznad linija grupiranja označavaju pokrivenost regije (%), a brojevi ispod linija grupiranja označavaju dužinu grane.
Nadalje, kako bi se potvrdila patogenost, četiri dobivena izolata S. sclerotiorum korištena su za inokulaciju osjetljive komercijalne sorte graha Giza 3 u uvjetima staklenika, što je u skladu s Kochovim postulatima (slika 1E). Iako su svi dobiveni gljivični izolati bili patogeni i mogli su inficirati zeleni grah (sorta Giza 3), uzrokujući tipične simptome bijele plijesni na svim nadzemnim dijelovima (slika 1F), posebno na stabljikama (slika 1G) i mahunama (slika 1H) 10 dana nakon inokulacije (dpi), izolat 3 bio je najagresivniji izolat u dva nezavisna eksperimenta. Izolat 3 imao je najveću težinu bolesti (%) na biljkama graha (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 i 76,7 ± 3,1 7, 14 i 21 dan nakon infekcije; slika 1F).
Identifikacija najinvazivnijeg izolata S. sclerotiorum #3 dodatno je potvrđena na osnovu sekvenciranja internog transkribiranog razmaknika (ITS) (Slika 1I). Filogenetska analiza između izolata #3 i 20 referentnih izolata/sojeva pokazala je visoku sličnost (>99%) između njih. Vrijedi napomenuti da izolat S. sclerotiorum #3 (533 bp) ima visoku sličnost s američkim izolatom S. sclerotiorum LPM36 izoliranim iz suhog sjemena graška (GenBank pristupni broj MK896659.1; 540 bp) i kineskim izolatom S. sclerotiorum YKY211 (GenBank pristupni broj OR206374.1; 548 bp), koji uzrokuje trulež stabljike ljubičice (Matthiola incana), a svi su grupirani odvojeno na vrhu dendrograma (Slika 1I). Nova sekvenca je deponovana u NCBI bazu podataka i nazvana „Sclerotinia sclerotiorum – izolat YN-25“ (GenBank pristupni broj PV202792). Može se vidjeti da je izolat 3 najinvazivniji izolat; stoga je ovaj izolat odabran za proučavanje u svim narednim eksperimentima.
Antibakterijska aktivnost diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Njemačka) pri različitim koncentracijama (12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/L) protiv izolata 3 S. sclerotiorum istražena je in vitro. Vrijedno je napomenuti da je L-ornitin pokazao antibakterijski učinak i postepeno inhibirao radijalni rast hifa S. sclerotiorum na način koji ovisi o dozi (Slika 2A, B). Pri najvišoj testiranoj koncentraciji (125 mg/L), L-ornitin je pokazao najveću stopu inhibicije rasta micelija (99,62 ± 0,27%; Slika 2B), što je bilo ekvivalentno komercijalnom fungicidu Rizolex-T (stopa inhibicije 99,45 ± 0,39%; Slika 2C) pri najvišoj testiranoj koncentraciji (10 mg/L), što ukazuje na sličnu efikasnost.
Slika 2. In vitro antibakterijska aktivnost L-ornitina protiv Sclerotinia sclerotiorum. (A) Poređenje antibakterijske aktivnosti različitih koncentracija L-ornitina protiv S. sclerotiorum sa komercijalnim fungicidom Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Stopa inhibicije (%) rasta micelija S. sclerotiorum nakon tretmana sa različitim koncentracijama L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/L) ili Rizolex-T (2, 4, 6, 8 i 10 mg/L), respektivno. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± SD pet bioloških ponavljanja (n = 5). Različita slova označavaju statističke razlike između tretmana (p < 0,05). (D, E) Probit model regresijske analize L-ornitina i komercijalnog fungicida Rizolex-T, respektivno. Regresijska linija probit modela prikazana je kao puna plava linija, a interval pouzdanosti (95%) prikazan je kao isprekidana crvena linija.
Pored toga, izvršena je probit regresijska analiza, a odgovarajući grafikoni su prikazani u Tabeli 1 i Slikama 2D,E. Ukratko, prihvatljiva vrijednost nagiba (y = 2,92x − 4,67) i pridružena značajna statistika (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 i p < 0,0001; Slika 2D) L-ornitina ukazuju na pojačanu antifungalnu aktivnost protiv S. sclerotiorum u poređenju sa komercijalnim fungicidom Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 i p < 0,0001) (Tabela 1).
Tabela 1. Vrijednosti polumaksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) i IC99 (mg/l) L-ornitina i komercijalnog fungicida „Rizolex-T“ protiv S. sclerotiorum.
Sveukupno, L-ornitin (250 mg/L) značajno je smanjio razvoj i težinu bijele plijesni na tretiranim biljkama običnog graha u poređenju sa netretiranim biljkama zaraženim S. sclerotiorum (kontrola; Slika 3A). Ukratko, iako se težina bolesti kod netretiranih zaraženih kontrolnih biljaka postepeno povećavala (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 i 92,33 ± 3,06%), L-ornitin je značajno smanjio težinu bolesti (%) tokom cijelog eksperimenta (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 i 26,36 ± 3,07) 7, 14 i 21 dan nakon tretmana (dpt), respektivno (Slika 3A). Slično tome, kada su biljke graha zaražene S. sclerotiorum tretirane sa 250 mg/L L-ornitina, površina ispod krive progresije bolesti (AUDPC) smanjila se sa 1274,33 ± 33,13 u netretiranoj kontroli na 281,03 ± 7,95, što je bilo nešto niže od površine pozitivne kontrole fungicidom Rizolex-T od 50 mg/L (183,61 ± 7,71; Slika 3B). Isti trend je uočen i u drugom eksperimentu.
Sl. 3. Učinak egzogene primjene L-ornitina na razvoj bijele truleži običnog graha uzrokovane Sclerotinia sclerotiorum u uvjetima staklenika. (A) Kriva progresije bolesti bijele plijesni običnog graha nakon tretmana sa 250 mg/L L-ornitina. (B) Površina ispod krive progresije bolesti (AUDPC) bijele plijesni običnog graha nakon tretmana L-ornitinom. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± SD pet bioloških ponavljanja (n = 5). Različita slova označavaju statistički značajne razlike između tretmana (p < 0,05).
Egzogena primjena 250 mg/L L-ornitina postepeno je povećavala visinu biljke (Sl. 4A), broj grana po biljci (Sl. 4B) i broj listova po biljci (Sl. 4C) nakon 42 dana. Dok je komercijalni fungicid Rizolex-T (50 mg/L) imao najveći učinak na sve proučavane nutritivne parametre, egzogena primjena 250 mg/L L-ornitina imala je drugi najveći učinak u poređenju s netretiranim kontrolama (Sl. 4A–C). S druge strane, tretman L-ornitinom nije imao značajan učinak na sadržaj fotosintetskih pigmenata klorofila a (Sl. 4D) i klorofila b (Sl. 4E), ali je neznatno povećao ukupni sadržaj karotenoida (0,56 ± 0,03 mg/g svježe težine) u poređenju s negativnom kontrolom (0,44 ± 0,02 mg/g svježe težine) i pozitivnom kontrolom (0,46 ± 0,02 mg/g svježe težine; Sl. 4F). Sveukupno, ovi rezultati ukazuju na to da L-ornitin nije fitotoksičan za tretirane mahunarke, te da čak može stimulirati njihov rast.
Sl. 4. Učinak primjene egzogenog L-ornitina na karakteristike rasta i fotosintetske pigmente listova graha zaraženih sa Sclerotinia sclerotiorum u uvjetima staklenika. (A) Visina biljke (cm), (B) Broj grana po biljci, (C) Broj listova po biljci, (D) Sadržaj hlorofila a (mg g-1 svježe težine), (E) Sadržaj hlorofila b (mg g-1 svježe težine), (F) Ukupni sadržaj karotenoida (mg g-1 svježe težine). Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± SD pet bioloških ponavljanja (n = 5). Različita slova označavaju statistički značajne razlike između tretmana (p < 0,05).
In situ histohemijska lokalizacija reaktivnih vrsta kisika (ROS; izraženo kao vodikov peroksid [H2O2]) i slobodnih radikala (izraženih kao superoksidni anioni [O2•−]) otkrila je da egzogena primjena L-ornitina (250 mg/L) značajno smanjuje akumulaciju H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Sl. 5A) i O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Sl. 5B) u poređenju sa akumulacijom i kod netretiranih zaraženih biljaka (173,31 ± 12,06 i 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, respektivno) i kod biljaka tretiranih sa 50 mg/L komercijalnog fungicida Rizolex-T (170,12 ± 9,50 i 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, respektivno) nakon 72 sata. Visoki nivoi H2O2 i O2•− akumulirali su se pod visokim pjenom (Sl. 5A, B). Slično tome, test malondialdehida (MDA) zasnovan na TCA pokazao je da su biljke graha zaražene S. sclerotiorum akumulirale veće nivoe MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) u svojim listovima (Sl. 5C). Međutim, egzogena primjena L-ornitina značajno je smanjila lipidnu peroksidaciju, što je dokazano smanjenjem sadržaja MDA u tretiranim biljkama (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Sl. 5. Učinak primjene egzogenog L-ornitina na glavne markere oksidativnog stresa i neenzimske mehanizme antioksidativne odbrane u listovima graha zaraženim sa S. sclerotiorum 72 sata nakon infekcije u uslovima staklenika. (A) Vodikov peroksid (H2O2; nmol g−1 FW) pri 72 hpt, (B) superoksidni anion (O2•−; nmol g−1 FW) pri 72 hpt, (C) malondialdehid (MDA; nmol g−1 FW) pri 72 hpt, (D) ukupni rastvorljivi fenoli (mg GAE g−1 FW) pri 72 hpt, (E) ukupni rastvorljivi flavonoidi (mg RE g−1 FW) pri 72 hpt, (F) ukupne slobodne aminokiseline (mg g−1 FW) pri 72 hpt i (G) sadržaj prolina (mg g−1 FW) pri 72 hpt. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju (srednja vrijednost ± SD) 5 bioloških ponavljanja (n = 5). Različita slova označavaju statistički značajne razlike između tretmana (p < 0,05).