Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Nanočestice inzulina (NP) s visokim sadržajem punjenja pronašle su različite primjene u različitim doznim oblicima. Cilj ovog rada je procijeniti učinak procesa liofilizacije i sušenja raspršivanjem na strukturu nanočestica hitosana opterećenih inzulinom, sa ili bez manitola kao krioprotektanta. Također smo procijenili kvalitet ovih nanočestica njihovim ponovnim otapanjem. Prije dehidracije, veličina čestica umreženih nanočestica hitosana/natrijum tripolifosfata/insulina optimizirana je na 318 nm, PDI je bio 0,18, efikasnost enkapsulacije 99,4%, a punjenje 25,01%. Nakon rekonstitucije, sve nanočestice, osim onih proizvedenih metodom liofilizacije bez upotrebe manitola, zadržale su svoju sfernu strukturu čestica. U poređenju s nanočesticama koje sadrže manitol dehidriranim bilo kojim raspršivanjem, nanočestice sušene raspršivanjem bez manitola također su pokazale najmanju prosječnu veličinu čestica (376 nm) i najveći sadržaj punjenja (25,02%) sa sličnom stopom enkapsulacije (98,7%) i PDI. (0,20) tehnikama sušenja ili liofilizacije. Osušene nanočestice sušenjem raspršivanjem bez manitola također su rezultirale najbržim oslobađanjem inzulina i najvećom efikasnošću ćelijskog unosa. Ovaj rad pokazuje da sušenje raspršivanjem može dehidrirati nanočestice inzulina bez potrebe za krioprotektantima u poređenju s konvencionalnim metodama liofilizacije, stvarajući veći kapacitet punjenja, niže potrebe za aditivima i značajnu prednost u operativnim troškovima.
Od svog otkrića 1922. godine1,2,3, inzulin i njegovi farmaceutski pripravci spasili su živote pacijenata s dijabetesom tipa 1 (T1DM) i dijabetesom tipa 2 (T1DM). Međutim, zbog svojih svojstava kao proteina visoke molekularne težine, inzulin se lako agregira, razgrađuje proteolitičkim enzimima i eliminira efektom prvog prolaska. Osobama s dijagnozom dijabetesa tipa 1 potrebne su injekcije inzulina do kraja života. Mnogim pacijentima kojima je prvobitno dijagnosticiran dijabetes tipa 2 također su potrebne dugotrajne injekcije inzulina. Dnevne injekcije inzulina ozbiljan su izvor svakodnevne boli i nelagode za ove osobe, s negativnim utjecajem na mentalno zdravlje. Kao rezultat toga, drugi oblici primjene inzulina koji uzrokuju manje nelagode, poput oralne primjene inzulina, opsežno se proučavaju5 jer imaju potencijal vratiti kvalitetu života približno 5 milijardi ljudi s dijabetesom širom svijeta.
Tehnologija nanočestica omogućila je značajan napredak u pokušajima oralne primjene inzulina4,6,7. Inzulin efikasno enkapsulira i štiti inzulin od degradacije radi ciljane isporuke na specifična mjesta na tijelu. Međutim, upotreba formulacija nanočestica ima nekoliko ograničenja, uglavnom zbog problema sa stabilnošću suspenzija čestica. Tokom skladištenja može doći do određene agregacije, što smanjuje bioraspoloživost nanočestica opterećenih inzulinom8. Osim toga, hemijska stabilnost polimerne matrice nanočestica i inzulina također se mora uzeti u obzir kako bi se osigurala stabilnost nanočestica inzulina (NP). Trenutno je tehnologija liofilizacije zlatni standard za stvaranje stabilnih NP, a istovremeno sprječava neželjene promjene tokom skladištenja9.
Međutim, liofilizacija zahtijeva dodavanje krioprotektanata kako bi se spriječilo da sferna struktura NP bude pod utjecajem mehaničkog naprezanja kristala leda. To značajno smanjuje opterećenje inzulinskim nanočesticama nakon liofilizacije, jer krioprotektant zauzima većinu težinskog omjera. Stoga se proizvedene inzulinske NP često smatraju neprikladnima za proizvodnju suhih praškastih formulacija, kao što su oralne tablete i oralni filmovi, zbog potrebe za velikim količinama suhih nanočestica za postizanje terapijskog prozora inzulina.
Sušenje raspršivanjem je dobro poznat i jeftin proces industrijske skale za proizvodnju suhih praškova iz tečnih faza u farmaceutskoj industriji10,11. Kontrola nad procesom formiranja čestica omogućava pravilnu enkapsulaciju nekoliko bioaktivnih spojeva12,13. Nadalje, postala je efikasna tehnika za pripremu enkapsuliranih proteina za oralnu primjenu. Tokom sušenja raspršivanjem, voda vrlo brzo isparava, što pomaže u održavanju niske temperature jezgra čestice11,14, omogućavajući njenu primjenu za enkapsulaciju komponenti osjetljivih na toplinu. Prije sušenja raspršivanjem, materijal za premazivanje treba temeljito homogenizirati s otopinom koja sadrži enkapsulirane sastojke11,14. Za razliku od sušenja liofilizacijom, homogenizacija prije enkapsulacije kod sušenja raspršivanjem poboljšava efikasnost enkapsulacije tokom dehidracije. Budući da proces enkapsulacije sušenjem raspršivanjem ne zahtijeva krioprotektante, sušenje raspršivanjem se može koristiti za proizvodnju osušenih NP s visokim sadržajem punjenja.
Ova studija izvještava o proizvodnji NP-ova opterećenih inzulinom umrežavanjem hitosana i natrijum tripolifosfata korištenjem metode ionskog gela. Ionska gelacija je metoda pripreme koja omogućava proizvodnju nanočestica putem elektrostatskih interakcija između dvije ili više ionskih vrsta pod određenim uvjetima. Za dehidrataciju optimiziranih umreženih nanočestica hitosana/natrijum tripolifosfata/insulina korištene su i tehnike liofilizacije i tehnike sušenja raspršivanjem. Nakon dehidracije, njihova morfologija je analizirana SEM-om. Njihova sposobnost rekombinacije procijenjena je mjerenjem njihove raspodjele veličine, površinskog naboja, PDI-ja, efikasnosti enkapsulacije i sadržaja punjenja. Kvalitet resolubiliziranih nanočestica proizvedenih različitim metodama dehidracije također je procijenjen poređenjem njihove zaštite od inzulina, ponašanja oslobađanja i efikasnosti ćelijskog preuzimanja.
pH miješane otopine i omjer hitosana i inzulina dva su ključna faktora koja utječu na veličinu čestica i efikasnost enkapsulacije (EE) konačnih NP, jer direktno utječu na proces ionotropne želirnosti. Pokazalo se da je pH miješane otopine u visokoj korelaciji s veličinom čestica i efikasnošću enkapsulacije (Slika 1a). Kao što je prikazano na Slici 1a, kako se pH povećavao od 4,0 do 6,0, prosječna veličina čestica (nm) se smanjivala, a EE se značajno povećavala, dok se kada se pH povećao na 6,5, prosječna veličina čestica počela povećavati, a EE je ostao nepromijenjen. Kako se omjer hitosana i inzulina povećava, povećava se i prosječna veličina čestica. Nadalje, nije uočena promjena EE kada su nanočestice pripremljene s masenim omjerom hitosana/insulina većim od 2,5:1 (w/w) (Slika 1b). Stoga su optimalni uvjeti pripreme u ovoj studiji (pH 6,0, maseni omjer hitosana/insulina 2,5:1) korišteni za pripremu. nanočestice opterećene inzulinom za daljnja istraživanja. Pod ovim uvjetima pripreme, prosječna veličina čestica nanočestica inzulina optimizirana je na 318 nm (slika 1c), PDI je bio 0,18, efikasnost ugrađivanja 99,4%, zeta potencijal 9,8 mv, a punjenje inzulinom 25,01% (m/m). Na osnovu rezultata transmisijske elektronske mikroskopije (TEM), optimizirane nanočestice su bile približno sferne i diskretne s relativno ujednačenom veličinom (slika 1d).
Optimizacija parametara nanočestica inzulina: (a) utjecaj pH na srednji promjer i efikasnost enkapsulacije (EE) nanočestica inzulina (pripremljenih pri masenom omjeru hitosana i inzulina 5:1); (b) hitozan i utjecaj masenog omjera inzulina na srednji promjer i efikasnost enkapsulacije (EE) nanočestica inzulina (pripremljenih pri pH 6); (c) raspodjela veličine čestica optimiziranih nanočestica inzulina; (d) TEM mikrografija optimiziranih nanočestica inzulina.
Dobro je poznato da je hitosan slab polielektrolit sa pKa od 6,5. Pozitivno je nabijen u kiselim medijima jer je njegova glavna amino grupa protonirana vodikovim ionima15. Stoga se često koristi kao nosač za enkapsulaciju negativno nabijenih makromolekula. U ovoj studiji, hitosan je korišten za enkapsulaciju inzulina s izoelektričnom tačkom od 5,3. Budući da se hitosan koristi kao materijal za premazivanje, s povećanjem njegovog udjela, debljina vanjskog sloja nanočestica se shodno tome povećava, što rezultira većom prosječnom veličinom čestica. Osim toga, veći nivoi hitosana mogu enkapsulirati više inzulina. U našem slučaju, EE je bio najveći kada je omjer hitosana i inzulina dostigao 2,5:1, a nije bilo značajne promjene u EE kada se omjer nastavio povećavati.
Pored odnosa hitosana i inzulina, pH je također igrao ključnu ulogu u pripremi NP. Gan i saradnici 17 proučavali su utjecaj pH na veličinu čestica hitosana. Otkrili su kontinuirano smanjenje veličine čestica sve dok pH nije dostigao 6,0, a značajno povećanje veličine čestica uočeno je pri pH > 6,0, što je u skladu s našim zapažanjima. Ovaj fenomen je posljedica činjenice da s povećanjem pH, molekula inzulina stiče negativno površinsko naboje, što pogoduje elektrostatičkim interakcijama s kompleksom hitosana/natrijum tripolifosfata (TPP), što rezultira malom veličinom čestica i visokom EE. Međutim, kada je pH podešen na 6,5, amino grupe na hitosanu su deprotonirane, što je rezultiralo savijanjem hitosana. Dakle, visoki pH rezultira manjom izloženošću amino iona TPP-u i inzulinu, što rezultira nižim umrežavanjem, većom konačnom prosječnom veličinom čestica i nižom EE.
Analiza morfoloških svojstava liofiliziranih i raspršivanjem sušenih NP može voditi u odabiru boljih tehnika dehidracije i formiranja praha. Poželjna metoda treba da obezbijedi stabilnost lijeka, ujednačen oblik čestica, visoko punjenje lijekom i dobru rastvorljivost u originalnom rastvoru. U ovoj studiji, radi boljeg poređenja dvije tehnike, tokom dehidracije su korištene NP insulina sa ili bez 1% manitola. Manitol se koristi kao sredstvo za povećanje volumena ili krioprotektant u različitim formulacijama suvog praha za liofilizaciju i sušenje raspršivanjem. Kod liofilizovanih nanočestica insulina bez manitola, kao što je prikazano na slici 2a, pod skenirajućom elektronskom mikroskopijom (SEM) uočena je visoko porozna struktura praha sa velikim, nepravilnim i hrapavim površinama. Malo diskretnih čestica je detektovano u prahu nakon dehidracije (slika 2e). Ovi rezultati ukazuju na to da je većina NP razgrađena tokom liofilizacije bez ikakvog krioprotektanta. Kod liofiliziranih i raspršivanjem sušenih nanočestica insulina koje sadrže 1% manitola, uočene su sferne nanočestice sa glatkim površinama (slika 2b,d,f,h). Nanočestice insulina sušene raspršivanjem bez manitola ostale su sferne, ali... naborane na površini (slika 2c). Sferne i naborane površine detaljnije su razmotrene u testovima ponašanja pri oslobađanju i apsorpcije u ćelije u nastavku. Na osnovu vidljivog izgleda osušenih NP, i NP sušene raspršivanjem bez manitola i NP liofilizirane i sušene raspršivanjem s manitolom dale su fine prahove NP (slika 2f,g,h). Što je veća površina između površina čestica, to je veća topljivost i stoga veća brzina oslobađanja.
Morfologija različitih dehidriranih NP inzulina: (a) SEM slika liofiliziranih NP inzulina bez manitola; (b) SEM slika liofiliziranih NP inzulina s manitolom; (c) NP inzulina sušene raspršivanjem bez manitola; SEM slika; (d) SEM slika NP inzulina sušenih raspršivanjem s manitolom; (e) slika liofiliziranog praha NP inzulina bez manitola; (f) slika liofiliziranih NP inzulina s manitolom; (g) Slika sušenog praha NP inzulina bez manitola; (h) slika sušenog praha NP inzulina s manitolom.
Tokom liofilizacije, manitol djeluje kao krioprotektant, održavajući NP u amorfnom obliku i sprječavajući oštećenje kristalima leda19. Nasuprot tome, nema koraka zamrzavanja tokom sušenja raspršivanjem. Stoga manitol nije potreban u ovoj metodi. U stvari, NP sušene raspršivanjem bez manitola dale su finije NP kao što je prethodno opisano. Međutim, manitol i dalje može djelovati kao punilo u procesu sušenja raspršivanjem kako bi NP dobile sferniju strukturu20 (slika 2d), što pomaže u postizanju ujednačenog ponašanja oslobađanja takvih enkapsuliranih NP. Osim toga, jasno je da se neke velike čestice mogu detektovati i u liofiliziranim i u sušenim raspršivanjem NP inzulina koje sadrže manitol (slika 2b,d), što može biti posljedica akumulacije manitola u jezgru čestice zajedno s enkapsuliranim inzulinom. Sloj hitosana. Vrijedi napomenuti da je u ovoj studiji, kako bi se osiguralo da sferična struktura ostane netaknuta nakon dehidracije, odnos manitola i hitosana održavan na 5:1, tako da velika količina punila može povećati veličinu čestica osušenih NP.
Spektroskopija Fourierove transformacije infracrvenog atenuiranog potpunog odraza (FTIR-ATR) okarakterizirala je fizičku smjesu slobodnog inzulina, hitosana, hitosana, TPP-a i inzulina. Sve dehidrirane NP-e okarakterizirane su korištenjem FTIR-ATR spektroskopije. Značajno je da su intenziteti traka od 1641, 1543 i 1412 cm-1 uočeni u enkapsuliranim NP-ima liofiliziranim s manitolom i u NP-ima sušenim raspršivanjem sa i bez manitola (Slika 3). Kao što je prethodno objavljeno, ova povećanja čvrstoće povezana su s umrežavanjem između hitosana, TPP-a i inzulina. Istraživanje interakcije između hitosana i inzulina pokazalo je da se u FTIR spektrima nanočestica hitosana napunjenih inzulinom, traka hitosana preklapa s trakom inzulina, povećavajući intenzitet karbonilne (1641 cm-1) i aminske (1543 cm-1) trake. Tripolifosfatne grupe TPP-a povezane su s amonijevim grupama u hitosanu, formirajući traku na 1412 cm-1.
FTIR-ATR spektri slobodnog inzulina, hitosana, fizičkih smješa hitosana/TPP/insulina i NP dehidriranih različitim metodama.
Nadalje, ovi rezultati su u skladu s onima prikazanim u SEM-u, koji je pokazao da su enkapsulirane NP ostale netaknute i kada su raspršene i liofilizirane s manitolom, ali u odsustvu manitola, samo sušenje raspršivanjem proizvodilo je enkapsulirane čestice. Nasuprot tome, FTIR-ATR spektralni rezultati NP liofiliziranih bez manitola bili su vrlo slični fizičkoj smjesi hitosana, TPP-a i inzulina. Ovaj rezultat ukazuje na to da unakrsne veze između hitosana, TPP-a i inzulina više nisu prisutne u NP liofiliziranim bez manitola. Struktura NP je uništena tokom liofilizacije bez krioprotektanta, što se može vidjeti u SEM rezultatima (slika 2a). Na osnovu morfologije i FTIR rezultata dehidriranih NP inzulina, samo liofilizirane, raspršivanjem sušene i NP bez manitola korištene su za eksperimente rekonstitucije, a NP bez manitola zbog razgradnje NP bez manitola tokom dehidracije. Diskutujte.
Dehidracija se koristi za dugotrajno skladištenje i ponovnu obradu u druge formulacije. Sposobnost suhih NP da se rekonstituišu nakon skladištenja je ključna za njihovu upotrebu u različitim formulacijama kao što su tablete i filmovi. Primijetili smo da se prosječna veličina čestica NP inzulina osušenih raspršivanjem u odsustvu manitola samo neznatno povećala nakon rekonstitucije. S druge strane, veličina čestica nanočestica inzulina osušenih raspršivanjem i liofiliziranih s manitolom značajno se povećala (Tabela 1). PDI i EE se nisu značajno promijenili (p > 0,05) nakon rekombinacije svih NP u ovoj studiji (Tabela 1). Ovaj rezultat ukazuje na to da je većina čestica ostala netaknuta nakon ponovnog rastvaranja. Međutim, dodavanje manitola rezultiralo je znatno smanjenim opterećenjem inzulinom liofiliziranih i sušenih raspršivanjem nanočestica manitola (Tabela 1). Nasuprot tome, sadržaj inzulina u NP osušenim raspršivanjem bez manitola ostao je isti kao i prije (Tabela 1).
Dobro je poznato da je punjenje nanočestica kritično kada se koriste za isporuku lijekova. Za NP s niskim punjenjem potrebne su vrlo velike količine materijala da bi se dostigao terapijski prag. Međutim, visoka viskoznost tako visokih koncentracija NP dovodi do neugodnosti i poteškoća pri oralnoj primjeni i injekcijskim formulacijama, respektivno 22. Osim toga, inzulinske NP mogu se koristiti i za izradu tableta i viskoznih biofilmova 23, 24, što zahtijeva upotrebu velikih količina NP pri niskim nivoima punjenja, što rezultira velikim tabletama i debelim biofilmovima koji nisu pogodni za oralnu primjenu. Stoga su dehidrirane NP s visokim opterećenjem inzulinom vrlo poželjne. Naši rezultati sugeriraju da visoko opterećenje inzulinom u NP sušenim raspršivanjem bez manitola može ponuditi mnoge atraktivne prednosti za ove alternativne metode isporuke.
Sve dehidrirane NP su čuvane u frižideru tri mjeseca. Rezultati SEM-a su pokazali da se morfologija svih dehidriranih NP nije značajno promijenila tokom tromjesečnog skladištenja (Sl. 4). Nakon rekonstitucije u vodi, sve NP su pokazale blagi pad EE i oslobodile približno malu količinu (~5%) inzulina tokom tromjesečnog perioda skladištenja (Tabela 2). Međutim, prosječna veličina čestica svih nanočestica se povećala. Veličina čestica NP sušenih raspršivanjem bez manitola povećala se na 525 nm, dok se veličina čestica NP sušenih raspršivanjem i liofiliziranih NP s manitolom povećala na 872 odnosno 921 nm (Tabela 2).
Morfologija različitih dehidriranih NP inzulina uskladištenih tri mjeseca: (a) SEM slika liofiliziranih NP inzulina s manitolom; (b) SEM slika nanočestica inzulina sušenih raspršivanjem bez manitola; (c) bez manitola SEM slike NP inzulina sušenih raspršivanjem.
Nadalje, uočeni su talozi u rekonstituiranim inzulinskim nanočesticama sušenim raspršivanjem manitolom i liofiliziranim (slika S2). To može biti uzrokovano velikim česticama koje se ne suspendiraju pravilno u vodi. Svi gore navedeni rezultati pokazuju da tehnika sušenja raspršivanjem može zaštititi inzulinske nanočestice od dehidracije i da se visoke količine inzulinskih nanočestica mogu dobiti bez ikakvih punila ili krioprotektanata.
Retencija inzulina testirana je u mediju pH = 2,5 s pepsinom, tripsinom i α-himotripsinom kako bi se demonstrirala zaštitna sposobnost NP-a od enzimske probave nakon dehidracije. Retencija inzulina dehidriranih NP-a upoređena je sa zadržavanjem inzulina kod svježe pripremljenih NP-a, a slobodni inzulin korišten je kao negativna kontrola. U ovoj studiji, slobodni inzulin pokazao je brzu eliminaciju inzulina u roku od 4 sata u sva tri enzimska tretmana (slika 5a-c). Nasuprot tome, testiranje eliminacije inzulina NP-a liofiliziranih s manitolom i NP-a sušenih raspršivanjem sa ili bez manitola pokazalo je značajno veću zaštitu ovih NP-a od enzimske probave, što je bilo slično zaštiti svježe pripremljenih NP-a inzulina (slika 1).5a-c). Uz pomoć nanočestica u pepsinu, tripsinu i α-himotripsinu, više od 50%, 60% i 75% inzulina moglo se zaštititi u roku od 4 sata (slika 5a-c). Ova sposobnost zaštite inzulina može povećati šansu za veću apsorpciju inzulina u krvotok25. Ovi rezultati sugeriraju da raspršivanje... Sušenje sa ili bez manitola i liofilizacija sa manitolom mogu sačuvati inzulinsko-zaštitnu sposobnost NP nakon dehidracije.
Ponašanje pri oslobađanju i zaštiti dehidriranih NP inzulina: (a) zaštita inzulina u rastvoru pepsina; (b) zaštita inzulina u rastvoru tripsina; (c) zaštita inzulina rastvorom α-himotripsina; (d) Ponašanje pri oslobađanju dehidriranih NP u rastvoru pH = 2,5; (e) Ponašanje pri oslobađanju dehidriranih NP u rastvoru pH = 6,6; (f) Ponašanje pri oslobađanju dehidriranih NP u rastvoru pH = 7,0.
Svježe pripremljene i rekonstituirane suhe nanočestice inzulina inkubirane su u različitim puferima (pH = 2,5, 6,6, 7,0) na 37 °C, simulirajući pH okruženje želuca, dvanaesnika i gornjeg dijela tankog crijeva, kako bi se ispitao učinak inzulina na inzulinsku rezistenciju. Ponašanje oslobađanja u različitim okruženjima. Fragment gastrointestinalnog trakta. Pri pH = 2,5, NP napunjene inzulinom i resolucibilizirane suhe NP inzulina pokazale su početno naglo oslobađanje unutar prvog sata, nakon čega je uslijedilo sporo oslobađanje tokom sljedećih 5 sati (Sl. 5d). Ovo brzo oslobađanje na početku najvjerovatnije je rezultat brze površinske desorpcije proteinskih molekula koje nisu potpuno imobilizirane u unutrašnjoj strukturi čestice. Pri pH = 6,5, NP napunjene inzulinom i rekonstituirane suhe NP inzulina pokazale su glatko i sporo oslobađanje tokom 6 sati, jer je pH testne otopine bio sličan pH otopine pripremljene s NP (Sl. 5e). Pri pH = 7, NP su bile nestabilne i gotovo potpuno razgrađene u prva dva sata (Sl. 5f). To je zato što se deprotonacija hitosana događa pri višem pH, što rezultira manje kompaktnom polimernom mrežom i oslobađanjem napunjenog inzulina.
Nadalje, inzulinske NP sušene raspršivanjem bez manitola pokazale su brži profil oslobađanja od ostalih dehidriranih NP (slika 5d-f). Kao što je prethodno opisano, rekonstituirane inzulinske NP sušene bez manitola pokazale su najmanju veličinu čestica. Male čestice pružaju veću površinu, tako da će većina relevantnog lijeka biti na ili blizu površine čestice, što rezultira brzim oslobađanjem lijeka26.
Citotoksičnost NP je ispitana MTT testom. Kao što je prikazano na slici S4, utvrđeno je da sve dehidrirane NP nemaju značajan uticaj na održivost ćelija pri koncentracijama od 50–500 μg/ml, što ukazuje na to da se sve dehidrirane NP mogu bezbedno koristiti za dostizanje terapijskog prozora.
Jetra je glavni organ putem kojeg inzulin vrši svoje fiziološke funkcije. HepG2 ćelije su ćelijska linija ljudskog hepatoma koja se obično koristi kao in vitro model preuzimanja hepatocita. Ovdje su HepG2 ćelije korištene za procjenu ćelijskog preuzimanja dehidriranih NP korištenjem metoda liofilizacije i sušenja raspršivanjem. Ćelijski unos konfokalnim laserskim skeniranjem korištenjem protočne citometrije i vida nakon nekoliko sati inkubacije sa slobodnim FITC inzulinom u koncentraciji od 25 μg/mL, svježe pripremljenim FITC inzulinom napunjenim NP i dehidriranim FITC inzulinom napunjenim NP pri jednakim koncentracijama inzulina. Izvršena su kvantitativna mikroskopska (CLSM) posmatranja. Liofilizirane NP bez manitola uništene su tokom dehidracije i nisu procijenjene u ovom testu. Intenziteti intracelularne fluorescencije svježe pripremljenih NP napunjenih inzulinom, liofiliziranih NP s manitolom i raspršivanjem sušenih NP sa i bez manitola (slika 6a) bili su 4,3, 2,6, 2,4 i 4,1 puta veći od slobodnih. FITC-insulin grupa, respektivno. (Sl. 6b). Ovi rezultati ukazuju na to da je inkapsulirani inzulin potentniji u ćelijskoj apsorpciji od slobodnog inzulina, uglavnom zbog manje veličine nanočestica napunjenih inzulinom proizvedenih u studiji.
Apsorpcija HepG2 ćelija nakon 4 sata inkubacije sa svježe pripremljenim NP i dehidriranim NP: (a) Raspodjela apsorpcije FITC-insulina od strane HepG2 ćelija. (b) Geometrijska sredina intenziteta fluorescencije analizirana protočnom citometrijom (n = 3), *P < 0,05 u poređenju sa slobodnim inzulinom.
Slično tome, CLSM slike su pokazale da su intenziteti FITC fluorescencije svježe pripremljenih FITC-insulinom napunjenih NP i FITC-insulinom napunjenih raspršivanjem sušenih NP (bez manitola) bili mnogo jači od onih kod ostalih uzoraka (slika 6a). Nadalje, uz dodatak manitola, veća viskoznost rastvora povećala je otpornost na ćelijsko preuzimanje, što je rezultiralo smanjenom proliferacijom inzulina. Ovi rezultati ukazuju na to da su raspršivanjem sušene NP bez manitola pokazale najveću efikasnost ćelijskog preuzimanja jer je veličina njihovih čestica bila manja od veličine liofiliziranih NP nakon ponovnog rastvaranja.
Hitosan (prosječne molekularne težine 100 KDa, 75–85% deacetiliran) je kupljen od Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Natrijum tripolifosfat (TPP) je kupljen od VWR (Radnor, Pennsylvania, SAD). Rekombinantni humani inzulin korišten u ovoj studiji je od Fisher Scientific (Waltham, MA, SAD). Humani inzulin obilježen fluorescein izotiocijanatom (FITC) i 4',6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorid (DAPI) su kupljeni od Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Ćelijska linija HepG2 je dobijena od ATCC (Manassas, Virginia, SAD). Svi ostali reagensi su bili analitičke ili hromatografske čistoće.
Pripremite CS rastvor koncentracije 1 mg/ml rastvaranjem u dvostruko destilovanoj vodi (DD voda) koja sadrži 0,1% sirćetne kiseline. Pripremite rastvore TPP i insulina koncentracije 1 mg/ml rastvaranjem u DD vodi i 0,1% sirćetnoj kiselini, respektivno. Preemulzija je pripremljena pomoću homogenizatora velike brzine Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, SAD). Postupak pripreme je sljedeći: prvo se 2 ml TPP rastvora doda u 4 ml insulinskog rastvora, a smjesa se miješa 30 minuta i dobro izmiješa. Zatim se miješani rastvor dodaje kap po kap u CS rastvor pomoću šprice uz miješanje velikom brzinom (10.000 o/min). Smjese su držane uz miješanje velikom brzinom (15.000 o/min) u ledenoj kupki 30 minuta, a zatim su podešene na određeni pH kako bi se dobile umrežene insulinske NP. Da bi se dodatno homogenizirale i smanjila veličina čestica insulinskih NP, one su sonicirane dodatnih 30 minuta u... ledenoj kupki pomoću sonikatora tipa sonde (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Njemačka).
NPS inzulina testirani su na Z-prosječni promjer, indeks polidisperznosti (PDI) i zeta potencijal korištenjem mjerenja dinamičkog raspršenja svjetlosti (DLS) pomoću Litesizera 500 (Anton Paar, Graz, Austrija) razrjeđivanjem u DD vodi na 25°C. Morfologija i raspodjela veličine okarakterizirane su Hitachi H7600 transmisionim elektronskim mikroskopom (TEM) (Hitachi, Tokio, Japan), a slike su potom analizirane korištenjem Hitachi softvera za obradu slika (Hitachi, Tokio, Japan). Da bi se procijenila efikasnost enkapsulacije (EE) i kapacitet punjenja (LC) NP inzulina, NP su pipetirane u ultrafiltracijske epruvete s graničnom molekularnom težinom od 100 kDa i centrifugirane na 500 x g tokom 30 minuta. Neenkapsulirani inzulin u filtratu kvantificiran je korištenjem Agilent 1100 Series HPLC sistema (Agilent, Santa Clara, Kalifornija, SAD) koji se sastoji od kvaternarne pumpe, autosamplera, grijača kolone i DAD detektora. Inzulin je analiziran. pomoću C18 kolone (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, SAD) i detektovano na 214 nm. Mobilna faza je bila acetonitril i voda, sa sadržajem 0,1% TFA, omjeri gradijenta od 10/90 do 100/0, a mjerenje je trajalo 10 minuta. Mobilna faza je pumpana brzinom protoka od 1,0 ml/min. Temperatura kolone je postavljena na 20 °C. Izračunajte procente EE i LC koristeći jednačine (1) i jednačinu (2).
Različiti omjeri CS/insulina, u rasponu od 2,0 do 4,0, testirani su kako bi se optimizirale nanočestice inzulina. Različite količine rastvora CS dodavane su tokom pripreme, dok je smjesa inzulina/TPP održavana konstantnom. Nanočestice inzulina pripremljene su u pH rasponu od 4,0 do 6,5 pažljivom kontrolom pH smjese nakon dodavanja svih rastvora (insulina, TPP i CS). EE i veličina čestica nanočestica inzulina procijenjene su pri različitim pH vrijednostima i masenim omjerima CS/insulina kako bi se optimiziralo formiranje nanočestica inzulina.
Optimizirane inzulinske NP su postavljene na aluminijsku posudu i prekrivene tkivom zategnutim trakom. Nakon toga, posude sa vijcima su postavljene u Labconco FreeZone liofilizator (Labconco, Kansas City, MO, SAD) opremljen sušilicom s poslužavnikom. Temperatura i vakuumski pritisak su postavljeni na -10 °C, 0,350 Torr tokom prva 2 sata, i 0 °C i 0,120 Torr tokom preostalih 22 sata od 24 sata kako bi se dobile suhe inzulinske NP.
Za proizvodnju inkapsuliranog inzulina korišten je Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Švicarska). Odabrani parametri sušenja bili su: temperatura 100 °C, protok ulaza 3 L/min i protok plina 4 L/min.
Nanočestice inzulina prije i nakon dehidracije karakterizirane su FTIR-ATR spektroskopijom. Dehidrirane nanočestice, kao i slobodni inzulin i hitosan, analizirani su pomoću Spectrum 100 FTIR spektrofotometra (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, SAD) opremljenog univerzalnim ATR dodatkom za uzorkovanje (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, SAD). Prosječne vrijednosti signala dobivene su iz 16 skeniranja pri rezoluciji od 4 cm2 u frekvencijskom rasponu od 4000-600 cm2.
Morfologija suhih inzulinskih NP procijenjena je SEM slikama liofiliziranih i raspršivanjem sušenih inzulinskih NP snimljenih Helios NanoLab 650 fokusiranim ionskim skenirajućim elektronskim mikroskopom (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, SAD). Glavni korišteni parametar bio je napon 5 keV i struja 30 mA.
Sve dehidrirane NP inzulina ponovo su rastvorene u dd vodi. Veličina čestica, PDI, EE i LC ponovo su testirani korištenjem iste metode koja je ranije spomenuta kako bi se procijenio njihov kvalitet nakon dehidracije. Stabilnost NP anhidroinsulina također je mjerena testiranjem svojstava NP nakon dužeg skladištenja. U ovoj studiji, sve NP nakon dehidracije su čuvane u hladnjaku tri mjeseca. Nakon tri mjeseca skladištenja, NP su testirane na morfološku veličinu čestica, PDI, EE i LC.
Rastvoriti 5 mL rekonstituiranih NP u 45 mL koji sadrži simuliranu želučanu tekućinu (pH 1,2, koja sadrži 1% pepsina), crijevnu tekućinu (pH 6,8, koja sadrži 1% tripsina) ili otopinu himotripsina (100 g/mL, u fosfatnom puferu, pH 7,8) kako bi se procijenila učinkovitost inzulina u zaštiti NP nakon dehidracije. Inkubirane su na 37°C uz brzinu miješanja od 100 rpm. 500 μL otopine sakupljeno je u različitim vremenskim tačkama, a koncentracija inzulina određena je HPLC-om.
Ponašanje oslobađanja svježe pripremljenih i dehidriranih NP inzulina in vitro testirano je metodom dijalizne vrećice (granična molekularna težina 100 kDa, Spectra Por Inc.). Svježe pripremljene i rekonstituirane suhe NP dijalizirane su u tekućinama pri pH 2,5, pH 6,6 i pH 7,0 (0,1 M fosfatno puferirana fiziološka otopina, PBS) kako bi se simulirala pH okolina želuca, dvanaesnika i gornjeg dijela tankog crijeva. Svi uzorci inkubirani su na 37 °C uz kontinuirano tresenje pri 200 rpm. Aspirirajte tekućinu izvan dijalizne vrećice od 5 mL u sljedećim vremenima: 0,5, 1, 2, 3, 4 i 6 sati, i odmah nadopunite volumen svježim dijalizatom. Kontaminacija inzulinom u tekućini analizirana je HPLC-om, a brzina oslobađanja inzulina iz nanočestica izračunata je iz odnosa oslobođenog slobodnog inzulina i ukupnog inzulina inkapsuliranog u nanočesticama (Jednačina 3).
Ćelije linije ćelija humanog hepatocelularnog karcinoma HepG2 uzgajane su u posudama prečnika 60 mm koristeći Dulbecco-ov modificirani Eagle-ov medijum (DMEM) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 IU/mL penicilina i 100 μg/mL streptomicina29. Kulture su održavane na 37°C, 95% relativne vlažnosti i 5% CO2. Za testove apsorpcije, HepG2 ćelije su zasijane u koncentraciji od 1 × 10⁶ ćelija/ml na Nunc Lab-Tek sistem komornih pločica sa 8 jažica (Thermo Fisher, NY, SAD). Za testove citotoksičnosti, zasijane su u ploče sa 96 jažica (Corning, NY, SAD) u gustini od 5 × 10⁶ ćelija/ml.
MTT test je korišten za procjenu citotoksičnosti svježe pripremljenih i dehidriranih inzulinskih NP30. HepG2 ćelije su zasijane u ploče sa 96 jažica pri gustoći od 5 × 10⁴ ćelija/mL i kultivirane 7 dana prije testiranja. Inzulinske NP su razrijeđene do različitih koncentracija (50 do 500 μg/mL) u mediju za kulturu, a zatim primijenjene na ćelije. Nakon 24 sata inkubacije, ćelije su isprane 3 puta sa PBS-om i inkubirane sa medijem koji sadrži 0,5 mg/ml MTT tokom dodatna 4 sata. Citotoksičnost je procijenjena mjerenjem enzimske redukcije žutog tetrazolijum MTT u ljubičasti formazan na 570 nm korištenjem Tecan infinite M200 pro spektrofotometra za čitanje ploča (Tecan, Männedorf, Švicarska).
Efikasnost ćelijskog unosa NP testirana je konfokalnom laserskom skenirajućom mikroskopijom i analizom protočnom citometrijom. Svaka rupica Nunc Lab-Tek sistema komornih pločica tretirana je slobodnim FITC-insulinom, NP napunjenim FITC-insulinom i rekonstituisanih 25 μg/mL dehidriranih FITC-insulinskih NP u istoj koncentraciji i inkubirana 4 sata. Ćelije su isprane 3 puta sa PBS-om i fiksirane sa 4% paraformaldehidom. Jezgra su obojena sa 4',6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI). Lokalizacija inzulina je posmatrana korištenjem Olympus FV1000 laserskog skenirajućeg/dvofotonskog konfokalnog mikroskopa (Olympus, Shinjuku City, Tokio, Japan). Za analizu protočnom citometrijom, iste koncentracije od 10 μg/mL slobodnog FITC-insulina, NP napunjenih FITC-insulinom i resolubiliziranih dehidriranih FITC-insulinskih NP dodane su na ploče sa 96 rupica zasijane HepG2 ćelijama i inkubirane 4 sata. Nakon 4 sata inkubacije, ćelije su uklonjene i isprane 3 puta sa FBS-om. 5 × 10⁴ ćelija po uzorku je analizirano pomoću BD LSR II protočnog citometra (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Sjedinjene Američke Države).
Sve vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. Poređenja između svih grupa su procijenjena korištenjem jednosmjerne ANOVA ili t-testa pomoću IBM SPSS Statistics 26 za Mac (IBM, Endicott, New York, SAD), a vrijednost p < 0,05 smatrana je statistički značajnom.
Ova studija pokazuje fleksibilnost i sposobnost sušenja raspršivanjem da dehidrira umrežene nanočestice hitosana/TPP/insulina s boljom rekonstitucijom u poređenju sa standardnim metodama sušenja zamrzavanjem korištenjem sredstava za povećanje volumena ili krioprotektanata i većim kapacitetom opterećenja. Optimizirane nanočestice inzulina dale su prosječnu veličinu čestica od 318 nm i efikasnost enkapsulacije od 99,4%. Rezultati SEM i FTIR nakon dehidracije pokazali su da je sferna struktura održana samo u nanočesticama sušenim raspršivanjem sa i bez manitola i liofiliziranim s manitolom, ali su se liofilizirane nanočestice bez manitola razgradile tokom dehidracije. U testu sposobnosti rekonstitucije, nanočestice inzulina sušene raspršivanjem bez manitola pokazale su najmanju prosječnu veličinu čestica i najveće opterećenje nakon rekonstitucije. Ponašanje oslobađanja svih ovih dehidriranih nanočestica pokazalo je da se brzo oslobađaju u rastvorima pH = 2,5 i pH = 7, te vrlo stabilne u rastvoru pH = 6,5. U poređenju s drugim ponovo rastvorenim dehidriranim nanočesticama, nanočestice sušene raspršivanjem bez manitola pokazale su najbrže... oslobađanje. Ovaj rezultat je u skladu s onim uočenim u testu ćelijske apsorpcije, budući da su nanočestice sušene raspršivanjem u odsustvu manitola gotovo u potpunosti zadržale efikasnost ćelijske apsorpcije svježe pripremljenih nanočestica. Ovi rezultati ukazuju na to da su suhe nanočestice inzulina pripremljene sušenjem raspršivanjem bez manitola najpogodnije za daljnju obradu u druge bezvodne oblike doziranja, kao što su oralne tablete ili bioadhezivni filmovi.
Zbog pitanja intelektualnog vlasništva, skupovi podataka generirani i/ili analizirani tokom trenutne studije nisu javno dostupni, ali su dostupni od odgovarajućih autora na razuman zahtjev.
Kagan, A. Dijabetes tipa 2: društveno i naučno porijeklo, medicinske komplikacije i implikacije za pacijente i druge. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Razvoj inkapsulacije inzulina: da li je oralna primjena sada moguća? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Nedavni napredak u oralnim sistemima za isporuku liposoma opterećenih inzulinom za liječenje dijabetesa. Interpretacija. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).