Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu CSS podršku. Za najbolje rezultate, preporučujemo da koristite noviju verziju preglednika (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazujemo stranicu bez stiliziranja ili JavaScripta.
Propionska kiselina (PPA) se koristi za proučavanje uloge mitohondrijalne disfunkcije u neurološkim razvojnim poremećajima kao što je poremećaj iz autističnog spektra. Poznato je da PPA remeti mitohondrijalnu biogenezu, metabolizam i promet. Međutim, efekti PPA na mitohondrijalnu dinamiku, fisiju i fuziju ostaju problematični zbog složene vremenske prirode ovih mehanizama. Ovdje koristimo komplementarne kvantitativne tehnike snimanja kako bismo istražili kako PPA utiče na mitohondrijalnu ultrastrukturu, morfologiju i dinamiku u neuronima sličnim SH-SY5Y ćelijama. PPA (5 mM) uzrokovao je značajno smanjenje mitohondrijalne površine (p < 0,01), Feretovog prečnika i obima (p < 0,05) i površine 2 (p < 0,01). Analiza lokatora mitohondrijalnih događaja pokazala je značajno povećanje (p < 0,05) fisijskih i fuzijskih događaja, čime se održava integritet mitohondrijalne mreže u stresnim uslovima. Pored toga, ekspresija mRNA cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) i OPA1 (p < 0,05) bila je značajno smanjena. 01). Ovo ilustruje remodeliranje mitohondrijalne morfologije, biogeneze i dinamike kako bi se održala funkcija u stresnim uslovima. Naši podaci pružaju novi uvid u efekte PPA na mitohondrijalnu dinamiku i ističu korisnost tehnika snimanja za proučavanje složenih regulatornih mehanizama uključenih u mitohondrijalne odgovore na stres.
Mitohondrije su sastavni učesnici u raznim ćelijskim funkcijama koje prevazilaze njihove tipične uloge u proizvodnji energije i biosintezi. Metabolizam mitohondrija je ključni regulator kalcijeve signalizacije, metaboličke i redoks homeostaze, inflamatorne signalizacije, epigenetičkih modifikacija, proliferacije ćelija, diferencijacije i programirane ćelijske smrti1. Posebno je mitohondrijski metabolizam ključan za razvoj, preživljavanje i funkciju neurona i široko je uključen u različite manifestacije neuropatologije2,3,4.
Tokom protekle decenije, metabolički status se pojavio kao centralni regulator neurogeneze, diferencijacije, sazrijevanja i plastičnosti5,6. Nedavno su mitohondrijalna morfologija i dinamika postale posebno važne komponente mitoze, dinamičkog procesa koji održava skup zdravih mitohondrija unutar ćelija. Mitohondrijalna dinamika regulirana je složenim međuzavisnim putevima, od mitohondrijalne biogeneze i bioenergetike do mitohondrijalne fisije, fuzije, transporta i čišćenja7,8. Poremećaj bilo kojeg od ovih integrativnih mehanizama narušava održavanje zdravih mitohondrijalnih mreža i ima duboke funkcionalne posljedice po neurološki razvoj9,10. Zaista, disregulacija mitohondrijalne dinamike uočena je kod mnogih psihijatrijskih, neurodegenerativnih i neurorazvojnih poremećaja, uključujući poremećaje iz autističnog spektra (ASD)11,12.
ASD je heterogeni neurološki razvojni poremećaj sa složenom genetskom i epigenetskom arhitekturom. Nasljednost ASD-a je neosporna, ali osnovna molekularna etiologija ostaje slabo shvaćena. Prikupljanje podataka iz predkliničkih modela, kliničkih studija i multi-omskih molekularnih skupova podataka pruža sve više dokaza o mitohondrijskoj disfunkciji kod ASD-a13,14. Prethodno smo proveli skrining metilacije DNK na nivou cijelog genoma u kohorti pacijenata sa ASD-om i identificirali različito metilirane gene grupirane duž mitohondrijalnih metaboličkih puteva15. Naknadno smo izvijestili o diferencijalnoj metilaciji centralnih regulatora mitohondrijalne biogeneze i dinamike, što je bilo povezano sa povećanim brojem kopija mtDNK i promijenjenim profilom metabolizma urina kod ASD-a16. Naši podaci pružaju sve više dokaza da mitohondrijalna dinamika i homeostaza igraju centralnu ulogu u patofiziologiji ASD-a. Stoga je poboljšanje mehanističkog razumijevanja odnosa između mitohondrijalne dinamike, morfologije i funkcije ključni cilj tekućih istraživanja neuroloških bolesti koje karakterizira sekundarna mitohondrijalna disfunkcija.
Molekularne tehnike se često koriste za proučavanje uloge specifičnih gena u mitohondrijalnim stresnim odgovorima. Međutim, ovaj pristup može biti ograničen višestrukom i vremenskom prirodom mehanizama mitotičke kontrole. Štaviše, diferencijalna ekspresija mitohondrijalnih gena je indirektni pokazatelj funkcionalnih promjena, posebno zato što se obično analizira samo ograničen broj gena. Stoga su predložene direktnije metode za proučavanje mitohondrijalne funkcije i bioenergetike17. Mitohondrijalna morfologija je usko povezana s mitohondrijalnom dinamikom. Oblik, povezanost i struktura mitohondrija su ključni za proizvodnju energije i preživljavanje mitohondrija i ćelija5,18. Štaviše, različite komponente mitoze fokusiraju se na promjene u mitohondrijskoj morfologiji, što može poslužiti kao korisne krajnje tačke mitohondrijalne disfunkcije i pružiti osnovu za naknadne mehanističke studije.
Mitohondrijalna morfologija se može direktno posmatrati pomoću transmisione elektronske mikroskopije (TEM), što omogućava detaljno proučavanje ćelijske ultrastrukture. TEM direktno vizualizuje morfologiju, oblik i strukturu mitohondrijalnih krista pri rezoluciji pojedinačnih mitohondrija, umjesto da se oslanja isključivo na transkripciju gena, ekspresiju proteina ili mitohondrijalne funkcionalne parametre u ćelijskim populacijama17,19,20. Osim toga, TEM olakšava proučavanje interakcija između mitohondrija i drugih organela, kao što su endoplazmatski retikulum i autofagosomi, koji igraju ključnu ulogu u mitohondrijskoj funkciji i homeostazi21,22. Stoga, TEM čini dobrom polaznom tačkom za proučavanje mitohondrijalne disfunkcije prije fokusiranja na specifične puteve ili gene. Kako mitohondrijalna funkcija postaje sve relevantnija za neuropatologiju, postoji jasna potreba za direktnim i kvantitativnim proučavanjem mitohondrijalne morfologije i dinamike u in vitro neuronskim modelima.
U ovom članku ispitujemo mitohondrijalnu dinamiku u neuronskom modelu mitohondrijalne disfunkcije kod poremećaja iz autističnog spektra. Prethodno smo izvijestili o diferencijalnoj metilaciji propionil-CoA karboksilaze beta (PCCB) u ASD15, podjedinici mitohondrijalnog enzima propionil-CoA karboksilaze PCC. Poznato je da disregulacija PCC uzrokuje toksičnu akumulaciju propionilnih derivata, uključujući propionsku kiselinu (PPA)23,24,25. Pokazalo se da PPA remeti neuronski metabolizam i mijenja ponašanje in vivo te je utvrđeni životinjski model za proučavanje neurorazvojnih mehanizama uključenih u ASD26,27,28. Osim toga, zabilježeno je da PPA remeti potencijal mitohondrijalne membrane, biogenezu i disanje in vitro te se široko koristi za modeliranje mitohondrijalne disfunkcije u neuronima29,30. Međutim, utjecaj mitohondrijalne disfunkcije izazvane PPA na mitohondrijalnu morfologiju i dinamiku ostaje slabo shvaćen.
Ova studija koristi komplementarne tehnike snimanja kako bi kvantificirala efekte PPA na mitohondrijalnu morfologiju, dinamiku i funkciju u SH-SY5Y ćelijama. Prvo smo razvili TEM metodu za vizualizaciju promjena u mitohondrijskoj morfologiji i ultrastrukturi17,31,32. S obzirom na dinamičku prirodu mitohondrija33, također smo koristili analizu lokalizatora mitohondrijalnih događaja (MEL) kako bismo kvantificirali promjene u ravnoteži između događaja fisije i fuzije, broja i volumena mitohondrija pod stresom PPA. Konačno, ispitali smo da li su mitohondrijalna morfologija i dinamika povezane s promjenama u ekspresiji gena uključenih u biogenezu, fisiju i fuziju. Uzeti zajedno, naši podaci ilustruju izazov razjašnjavanja složenosti mehanizama koji regulišu mitohondrijalnu dinamiku. Ističemo korisnost TEM-a u proučavanju mitohondrijalne morfologije kao mjerljive konvergentne krajnje tačke mitoze u SH-SY5Y ćelijama. Pored toga, ističemo da TEM podaci pružaju najbogatije informacije kada se kombinuju sa tehnikama snimanja koje također hvataju dinamičke događaje kao odgovor na metabolički stres. Dalja karakterizacija molekularnih regulatornih mehanizama koji podržavaju mitozu neuronskih ćelija može pružiti važan uvid u mitohondrijalnu komponentu nervnog sistema i neurodegenerativne bolesti.
Da bi se izazvao mitohondrijski stres, SH-SY5Y ćelije su tretirane PPA korištenjem 3 mM i 5 mM natrijum propionata (NaP). Prije TEM-a, uzorci su podvrgnuti kriogenoj pripremi uzoraka korištenjem zamrzavanja pod visokim pritiskom i zamrzavanja (Slika 1a). Razvili smo automatizirani cjevovod za analizu mitohondrijske slike kako bismo izmjerili osam morfoloških parametara mitohondrijskih populacija u tri biološka ponavljanja. Otkrili smo da je tretman PPA značajno promijenio četiri parametra: površinu 2, površinu, perimetar i Feretov promjer (Slika 1b-e). Površina 2 se značajno smanjila i tretmanom PPA sa 3 mM i 5 mM (p = 0,0183 i p = 0,002, respektivno) (Slika 1b), dok su se površina (p = 0,003), perimetar (p = 0,0106) i Feretov promjer značajno smanjili. Došlo je do značajnog smanjenja (p = 0,0172) u grupi tretmana sa 5 mM u poređenju sa kontrolnom grupom (Slika 1c-e). Značajna smanjenja površine i obima pokazala su da su ćelije tretirane sa 5 mM PPA imale manje, zaobljenije mitohondrije i da su te mitohondrije bile manje izdužene od onih u kontrolnim ćelijama. Ovo je također u skladu sa značajnim smanjenjem Feretovog promjera, nezavisnog parametra koji ukazuje na smanjenje najveće udaljenosti između rubova čestica. Uočene su promjene u ultrastrukturi krista: kriste su postale manje izražene pod utjecajem PPA stresa (Slika 1a, panel B). Međutim, nisu sve slike jasno odražavale ultrastrukturu krista, tako da kvantitativna analiza ovih promjena nije provedena. Ovi TEM podaci mogu odražavati tri moguća scenarija: (1) PPA pojačava fisiju ili inhibira fuziju, uzrokujući smanjenje postojećih mitohondrija; (2) poboljšana biogeneza stvara nove, manje mitohondrije ili (3) istovremeno inducira oba mehanizma. Iako se ovi uvjeti ne mogu razlikovati TEM-om, značajne morfološke promjene ukazuju na promjene u mitohondrijalnoj homeostazi i dinamici pod PPA stresom. Naknadno smo istražili dodatne parametre kako bismo dalje karakterizirali ovu dinamiku i potencijalne mehanizme koji leže u njenoj osnovi.
Propionska kiselina (PPA) remodelira morfologiju mitohondrija. (a) Reprezentativne slike transmisijske elektronske mikroskopije (TEM) koje pokazuju da se veličina mitohondrija smanjuje, a mitohondrije postaju manje i zaobljenije s povećanjem tretmana PPA; 0 mM (netretirano), 3 mM i 5 mM, respektivno. Crvene strelice označavaju mitohondrije. (b–e) SH-SY5Y ćelije tretirane PPA tokom 24 sata pripremljene su za TEM, a rezultati su analizirani korištenjem Fiji/ImageJ. Četiri od osam parametara pokazala su značajne razlike između kontrolnih (netretiranih, 0 mM PPA) i tretiranih (3 mM i 5 mM PPA) ćelija. (b) Regija 2, (c) Površina, (d) Perimetar, (e) Feretov promjer. Jednosmjerna analiza varijanse (kontrola u odnosu na tretman) i Dunnettov test višestrukog poređenja korišteni su za određivanje značajnih razlika (p < 0,05). Tačke podataka predstavljaju prosječnu vrijednost mitohondrija za svaku pojedinačnu ćeliju, a stupci greške predstavljaju srednju vrijednost ± SEM. Prikazani podaci predstavljaju n = 3, najmanje 24 ćelije po ponavljanju; ukupno je analizirano 266 slika; * označava p < 0,05, ** označava p < 0,01.
Kako bismo dalje okarakterizirali kako mitohondrijska dinamika reaguje na PPA, obojili smo mitohondrije tetrametilrodamin etil esterom (TMRE) i koristili mikroskopiju sa vremenskim prekidom i MEL analizu kako bismo lokalizovali i kvantificirali mitohondrije nakon 24 sata pri 3 i 5 mM PPA. Tretman događaja fisije i fuzije. (Slika 2a). Nakon MEL analize, mitohondrije su dalje analizirane kako bi se kvantificirao broj mitohondrijskih struktura i njihov prosječni volumen. Uočili smo malo, ali značajno povećanje broja događaja fisije koji se javljaju pri 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] u poređenju sa finijom [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] i fuzijom [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] i fuzijom [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] [0,05)] [<0,05)], gdje su događaji fuzije bili značajno povećani pri 5 mM u poređenju sa kontrolom (Slika 3b). Broj mitohondrija se značajno povećao i pri 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] i pri 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Sl. 3c), dok je prosječni volumen svake mitohondrijske strukture ostao nepromijenjen (Sl. 3c). 3d). Uzeto zajedno, ovo sugerira da remodeliranje mitohondrijalne dinamike služi kao kompenzacijski odgovor koji uspješno održava integritet mitohondrijske mreže. Povećanje broja fisijskih događaja pri 3 mM PPA sugerira da je povećanje broja mitohondrija djelimično posljedica mitohondrijalne fisije, ali s obzirom na to da prosječni volumen mitohondrija ostaje u suštini nepromijenjen, biogeneza se ne može isključiti kao dodatni kompenzacijski odgovor. Međutim, ovi podaci su u skladu s manjim, okruglim mitohondrijalnim strukturama uočenim TEM-om i također pokazuju značajne promjene u mitohondrijskoj dinamici izazvane PPA.
Propionska kiselina (PPA) indukuje dinamičko mitohondrijsko remodeliranje kako bi se održao integritet mreže. SH-SY5Y ćelije su kultivirane, tretirane sa 3 i 5 mM PPA tokom 24 sata i obojene sa TMRE i Hoechst 33342, nakon čega je uslijedila MEL analiza. (a) Reprezentativne slike mikroskopije sa vremenskim intervalom koje prikazuju projekcije boje i binarizovane maksimalne projekcije intenziteta u vremenu 2 (t2) za svako stanje. Odabrana područja naznačena na svakoj binarnoj slici su poboljšana i prikazana u 3D u tri različita vremenska okvira (t1-t3) kako bi se ilustrovala dinamika tokom vremena; događaji fuzije su označeni zelenom bojom; događaji fisije su označeni zelenom bojom. Prikazano crvenom bojom. (b) Prosječan broj dinamičkih događaja po stanju. (c) Prosječan broj mitohondrijskih struktura po ćeliji. (d) Prosječna zapremina (µm3) svake mitohondrijske strukture po ćeliji. Prikazani podaci su reprezentativni za n = 15 ćelija po grupi tretmana. Prikazane trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± SEM, skala = 10 μm, * p < 0,05.
Propionska kiselina (PPA) uzrokuje transkripcijsku supresiju gena povezanih s mitohondrijalnom dinamikom. SH-SY5Y ćelije su tretirane sa 3 i 5 mM PPA tokom 24 sata. Relativna kvantifikacija gena je izvršena korištenjem RT-qPCR i normalizovana na B2M. Geni mitohondrijalne biogeneze (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 i (d) NFE2L2. Geni mitohondrijalne fuzije i fisije (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 i (i) DRP1. Značajne razlike (p < 0,05) su testirane korištenjem jednosmjerne ANOVA (kontrola vs. tretman) i Dunnettovog testa višestruke komparacije: * označava p < 0,05, ** označava p < 0,01, a **** označava p < 0,0001. Trake predstavljaju srednju ekspresiju ± SEM. Prikazani podaci predstavljaju n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) i n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) bioloških replikata.
Podaci iz TEM i MEL analiza zajedno ukazuju na to da PPA mijenja morfologiju i dinamiku mitohondrija. Međutim, ove tehnike snimanja ne pružaju uvid u osnovne mehanizme koji pokreću ove procese. Stoga smo ispitali ekspresiju mRNA devet ključnih regulatora mitohondrijalne dinamike, biogeneze i mitoze kao odgovor na tretman PPA. Kvantificirali smo onkogen mijeloma ćelija (cMYC), nuklearni respiratorni faktor (NRF1), mitohondrijski transkripcijski faktor 1 (TFAM), transkripcijski faktor sličan NFE2 BZIP (NFE2L2), protein sličan gastrinu 2 (STOML2), atrofiju optičkog živca 1 (OPA1), mitofuzin 1 (MFN1), mitofuzin 2 (MFN2) i protein povezan s dinaminom 1 (DRP1) nakon 24 sata tretmana sa 3 mM i 5 mM PPA. Uočili smo tretman PPA sa 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 i p < 0,0001, respektivno) i 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001). (Slika 3a-c). Smanjenje ekspresije mRNA bilo je ovisno o dozi: ekspresija cMYC, NRF1 i TFAM smanjila se za 5,7, 2,6 i 1,9 puta pri 3 mM, respektivno, i za 11,2, 3 i 2,2 puta pri 5 mM. Nasuprot tome, centralni gen redoks biogeneze NFE2L2 nije promijenjen ni pri jednoj koncentraciji PPA, iako je uočen sličan trend smanjene ekspresije ovisan o dozi (Slika 3d).
Također smo ispitali ekspresiju klasičnih gena uključenih u regulaciju fisije i fuzije. Smatra se da je STOML2 uključen u fuziju, mitofagiju i biogenezu, a njegova ekspresija je značajno smanjena (p < 0,0001) za 3 mM (promjena od 2,4 puta) i 5 mM (promjena od 2,8 puta) PPA (Slika 1). 3d). Slično tome, ekspresija fuzijskog gena OPA1 smanjena je pri 3 mM (promjena od 1,6 puta) i 5 mM (promjena od 1,9 puta) PPA (p = 0,006 i p = 0,0024, respektivno) (Slika 3f). Međutim, nismo pronašli značajne razlike u ekspresiji fuzijskih gena MFN1, MFN2 ili fisijskog gena DRP1 pod 24-satnim PPA stresom (Slika 3g–i). Osim toga, otkrili smo da se nivoi četiri fuzijska i fisijska proteina (OPA1, MFN1, MFN2 i DRP1) nisu promijenili pod istim uslovima (Sl. 4a-d). Važno je napomenuti da ovi podaci odražavaju jednu vremensku tačku i ne moraju odražavati promjene u ekspresiji proteina ili nivoima aktivnosti tokom ranih faza PPA stresa. Međutim, značajno smanjenje ekspresije cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 i OPA1 ukazuje na značajnu transkripcijsku disregulaciju mitohondrijalnog metabolizma, biogeneze i dinamike. Pored toga, ovi podaci ističu korisnost tehnika snimanja za direktno proučavanje promjena završnog stanja mitohondrijalne funkcije.
Nivoi proteina fuzijskog i fisijskog faktora nisu se promijenili nakon tretmana propionskom kiselinom (PPA). SH-SY5Y ćelije su tretirane sa 3 i 5 mM PPA tokom 24 sata. Nivoi proteina su kvantificirani Western blot analizom, a nivoi ekspresije su normalizirani na ukupni protein. Prikazana je prosječna ekspresija proteina i reprezentativni Western blot rezultati ciljnog i ukupnog proteina. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Trake predstavljaju srednju vrijednost ± SEM, a prikazani podaci su reprezentativni za n = 3 biološka ponavljanja. Višestruka poređenja (p < 0,05) su izvršena korištenjem jednosmjerne analize varijanse i Dunnettovog testa. Originalni gel i blot su prikazani na slici S1.
Mitohondrijalna disfunkcija povezana je s multisistemskim bolestima, od metaboličkih, kardiovaskularnih i mišićnih bolesti do neuroloških bolesti1,10. Mnoge neurodegenerativne i neurodegenerativne bolesti povezane su s mitohondrijalnom disfunkcijom, što naglašava važnost ovih organela tokom cijelog životnog vijeka mozga. Ove bolesti uključuju Parkinsonovu bolest, Alzheimerovu bolest i ASD3,4,18. Međutim, pristup moždanom tkivu za proučavanje ovih bolesti je otežan, posebno na mehanističkom nivou, što čini ćelijske modelne sisteme neophodnom alternativom. U ovoj studiji koristimo ćelijski modelni sistem koji koristi PPA-tretirane SH-SY5Y ćelije kako bismo rekapitulirali mitohondrijalnu disfunkciju uočenu kod neuronskih bolesti, posebno poremećaja iz autističnog spektra. Korištenje ovog PPA modela za proučavanje mitohondrijalne dinamike u neuronima može pružiti uvid u etiologiju ASD-a.
Istražili smo mogućnost korištenja TEM-a za praćenje promjena u mitohondrijskoj morfologiji. Važno je napomenuti da se TEM mora pravilno koristiti kako bi se maksimizirala njegova efikasnost. Priprema krio-uzoraka omogućava bolje očuvanje neuronskih struktura istovremenim fiksiranjem ćelijskih komponenti i smanjenjem stvaranja artefakata34. U skladu s tim, primijetili smo da neuronima slične SH-SY5Y ćelije imaju intaktne subcelularne organele i izdužene mitohondrije (Slika 1a). Ovo ističe korisnost kriogenih tehnika pripreme za proučavanje mitohondrijalne morfologije u modelima neuronskih ćelija. Iako su kvantitativna mjerenja ključna za objektivnu analizu TEM podataka, još uvijek ne postoji konsenzus o tome koje specifične parametre treba mjeriti kako bi se potvrdile mitohondrijalne morfološke promjene. Na osnovu velikog broja studija koje su kvantitativno ispitale mitohondrijsku morfologiju17,31,32, razvili smo automatizirani cjevovod za analizu mitohondrijalne slike koji mjeri osam morfoloških parametara, i to: površinu, površinu2, omjer stranica, obim, kružnost, stepen , Feretov promjer i zaobljenost.
Među njima, PPA je značajno smanjio površinu 2, površinu, perimetar i Feretov promjer (Sl. 1b-e). Ovo je pokazalo da su mitohondrije postale manje i zaobljenije, što je u skladu s prethodnim studijama koje su pokazale smanjenje površine mitohondrija nakon 72 sata mitohondrijalnog stresa izazvanog PPA30. Ove morfološke karakteristike mogu ukazivati ​​na mitohondrijalnu fisiju, neophodan proces za izdvajanje oštećenih komponenti iz mitohondrijalne mreže kako bi se potaknula njihova degradacija putem mitofagije35,36,37. S druge strane, smanjenje prosječne veličine mitohondrija može biti povezano s povećanom biogenezom, što rezultira stvaranjem malih nascentnih mitohondrija. Povećana fisija ili biogeneza predstavlja kompenzacijski odgovor za održavanje mitoze protiv mitohondrijalnog stresa. Međutim, smanjeni rast mitohondrija, oštećena fuzija ili druga stanja ne mogu se isključiti.
Iako slike visoke rezolucije kreirane TEM-om omogućavaju određivanje morfoloških karakteristika na nivou pojedinačnih mitohondrija, ova metoda proizvodi dvodimenzionalne snimke u jednom trenutku. Da bismo proučili dinamičke odgovore na metabolički stres, obojili smo mitohondrije sa TMRE i koristili mikroskopiju sa vremenskim intervalom i MEL analizom, koja omogućava visokopropusnu 3D vizualizaciju promjena u mitohondrijskoj mreži tokom vremena33,38. Uočili smo suptilne, ali značajne promjene u mitohondrijskoj dinamici pod PPA stresom (Slika 2). Pri 3 mM, broj događaja fisije se značajno povećao, dok su događaji fuzije ostali isti kao u kontroli. Povećanje broja i događaja fisije i fuzije uočeno je pri 5 mM PPA, ali su ove promjene bile približno proporcionalne, što sugerira da kinetika fisije i fuzije dostiže ravnotežu pri višim koncentracijama (Slika 2b). Prosječni volumen mitohondrija ostao je nepromijenjen i pri 3 i pri 5 mM PPA, što ukazuje da je integritet mitohondrijalne mreže očuvan (Slika 2d). Ovo odražava sposobnost dinamičkih mitohondrijalnih mreža da reaguju na blagi metabolički stres kako bi efikasno održavale homeostazu bez izazivanja fragmentacije mreže. Pri 3 mM PPA, povećanje fisije je dovoljno da podstakne prelazak u novu ravnotežu, ali je potrebno dublje kinetičko remodeliranje kao odgovor na stres izazvan višim koncentracijama PPA.
Broj mitohondrija se povećao pri obje koncentracije stresa PPA, ali se prosječni volumen mitohondrija nije značajno promijenio (Slika 2c). To može biti posljedica povećane biogeneze ili povećane diobe; međutim, u odsustvu značajnog smanjenja prosječnog volumena mitohondrija, vjerovatnije je da se biosinteza povećava. Međutim, podaci na Slici 2 podržavaju postojanje dva kompenzacijska mehanizma: povećanje broja događaja fisije, što je u skladu s pojačanom regulacijom mitohondrijalne fisije, i povećanje broja događaja, što je u skladu s mitohondrijalnom biogenezom. U konačnici, dinamička kompenzacija za blagi stres može se sastojati od istovremenih procesa koji uključuju fisiju, fuziju, biogenezu i mitofagiju. Iako su prethodni autori pokazali da PPA pojačava mitozu30,39 i mitofagiju29, mi pružamo dokaze za remodeliranje dinamike mitohondrijalne fisije i fuzije kao odgovor na PPA. Ovi podaci potvrđuju morfološke promjene uočene TEM-om i pružaju daljnji uvid u mehanizme povezane s mitohondrijalnom disfunkcijom izazvanom PPA.
Budući da ni TEM ni MEL analiza nisu pružile direktne dokaze o mehanizmima regulacije gena koji leže u osnovi uočenih morfoloških promjena, ispitali smo ekspresiju RNK gena uključenih u mitohondrijski metabolizam, biogenezu i dinamiku. cMYC proto-onkogen je transkripcijski faktor uključen u regulaciju mitohondrija, glikolize, metabolizma aminokiselina i masnih kiselina40. Osim toga, poznato je da cMYC reguliše ekspresiju skoro 600 mitohondrijskih gena uključenih u mitohondrijsku transkripciju, translaciju i sastavljanje kompleksa, uključujući NRF1 i TFAM41. NRF1 i TFAM su dva centralna regulatora mitoze, koji djeluju nizvodno od PGC-1α kako bi aktivirali replikaciju mtDNK. Ovaj put se aktivira signalizacijom cAMP i AMPK i osjetljiv je na potrošnju energije i metabolički stres. Također smo ispitali NFE2L2, redoks regulator mitohondrijske biogeneze, kako bismo utvrdili da li bi efekti PPA mogli biti posredovani oksidativnim stresom.
Iako je ekspresija NFE2L2 ostala nepromijenjena, otkrili smo konzistentno smanjenje ekspresije cMYC, NRF1 i TFAM ovisno o dozi nakon 24 sata tretmana sa 3 mM i 5 mM PPA (Slika 3a-c). Smanjenje ekspresije cMYC je prethodno zabilježeno kao odgovor na mitohondrijski stres42, i obrnuto, smanjenje ekspresije cMYC može uzrokovati mitohondrijalnu disfunkciju remodeliranjem mitohondrijalnog metabolizma, mrežne povezanosti i polarizacije membrane43. Zanimljivo je da je cMYC također uključen u regulaciju mitohondrijalne fisije i fuzije42,43 i poznato je da povećava fosforilaciju DRP1 i lokalizaciju mitohondrija tokom diobe ćelija44, kao i da posreduje u mitohondrijalnom morfološkom remodeliranju u neuronskim matičnim ćelijama45. Zaista, fibroblasti s nedostatkom cMYC pokazuju smanjenu veličinu mitohondrija, što je u skladu s promjenama izazvanim stresom PPA43. Ovi podaci ilustruju zanimljiv, ali još uvijek nejasan odnos između cMYC i mitohondrijalne dinamike, pružajući zanimljivu metu za buduće studije remodeliranja izazvanog stresom PPA.
Smanjenje NRF1 i TFAM je u skladu s ulogom cMYC kao važnog transkripcijskog aktivatora. Ovi podaci su također u skladu s prethodnim studijama na ljudskim ćelijama raka debelog crijeva koje pokazuju da PPA smanjuje ekspresiju NRF1 mRNA nakon 22 sata, što je povezano s iscrpljivanjem ATP-a i povećanjem ROS46. Ovi autori su također izvijestili da se ekspresija TFAM povećala nakon 8,5 sati, ali se vratila na početne nivoe nakon 22 sata. Nasuprot tome, Kim i sar. (2019) su pokazali da je ekspresija TFAM mRNA značajno smanjena nakon 4 sata stresa PPA u SH-SY5Y ćelijama; međutim, nakon 72 sata, ekspresija TFAM proteina je značajno povećana, a broj kopija mtDNK je značajno povećan. Dakle, smanjenje broja gena mitohondrijalne biogeneze koje smo primijetili nakon 24 sata ne isključuje mogućnost da je povećanje broja mitohondrija povezano s aktivacijom biogeneze u ranijim vremenskim tačkama. Prethodne studije su pokazale da PPA značajno povećava ekspresiju PGC-1α mRNA i proteina u SH-SY5Y ćelijama nakon 4 sata i 30 minuta, dok propionska kiselina pojačava mitohondrijalnu biogenezu u hepatocitima teladi putem PGC-1α nakon 12 sati i 39 minuta. Zanimljivo je da PGC-1α nije samo direktni transkripcijski regulator NRF1 i TFAM, već je pokazano da reguliše i aktivnost MFN2 i DRP1 regulisanjem fisije i fuzije47. Uzevši sve u obzir, ovo ističe blisku povezanost mehanizama koji regulišu mitohondrijalne kompenzatorne odgovore izazvane PPA. Štaviše, naši podaci odražavaju značajnu disregulaciju transkripcijske regulacije biogeneze i metabolizma pod stresom izazvanim PPA.
Geni STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 i DRP1 spadaju među centralne regulatore mitohondrijalne fisije, fuzije i dinamike37,48,49. Postoje mnogi drugi geni uključeni u mitohondrijalnu dinamiku, međutim, prethodno je utvrđeno da su STOML2, OPA1 i MFN2 različito metilirani u kohortama ASD-a,16 a nekoliko nezavisnih studija je izvijestilo o promjenama u ovim transkripcijskim faktorima kao odgovor na mitohondrijalni stres50,51.52. Ekspresija i OPA1 i STOML2 značajno je smanjena tretmanom sa 3 mM i 5 mM PPA (slika 3e, f). OPA1 je jedan od klasičnih regulatora mitohondrijalne fuzije putem direktne interakcije sa MFN1 i 2 i igra ulogu u remodeliranju krista i mitohondrijskoj morfologiji53. Precizna uloga STOML2 u mitohondrijskoj dinamici ostaje nejasna, ali dokazi ukazuju na to da igra ulogu u mitohondrijskoj fuziji, biogenezi i mitofagiji.
STOML2 je uključen u održavanje mitohondrijskog respiratornog spajanja i formiranje kompleksa respiratornog lanca54,55, a pokazalo se da značajno mijenja metaboličke karakteristike ćelija raka56. Studije su pokazale da STOML2 promovira potencijal mitohondrijske membrane i biogenezu putem interakcije s BAN-om i kardiolipinom 55, 57, 58. Osim toga, nezavisne studije su pokazale da interakcija između STOML2 i PINK1 reguliše mitofagiju59,60. Posebno je poznato da STOML2 direktno interaguje i stabilizuje MFN2, a također igra važnu ulogu u stabilizaciji dugih OPA1 izoformi inhibirajući proteazu odgovornu za degradaciju OPA153,61,62. Smanjenje ekspresije STOML2 uočeno u PPA reakcijama može učiniti ove fuzijske proteine ​​podložnijim degradaciji putem puteva zavisnih od ubikvitina i proteasoma48. Iako precizna uloga STOML2 i OPA1 u dinamičkom odgovoru na PPA nije jasna, smanjena ekspresija ovih fuzijskih gena (Slika 3) može poremetiti ravnotežu između fisije i fuzije i dovesti do smanjenja veličine mitohondrija (Slika 3). 1).
S druge strane, ekspresija proteina OPA1 ostala je nepromijenjena nakon 24 sata, dok se nivoi mRNA i proteina MFN1, MFN2 ili DRP1 nisu značajno promijenili nakon tretmana PPA (Sl. 3g-i, Sl. 4). Ovo može ukazivati ​​na to da nema promjena u regulaciji ovih faktora uključenih u mitohondrijalnu fuziju i fisiju. Međutim, vrijedi napomenuti da je svaki od ova četiri gena također reguliran posttranskripcijskim modifikacijama (PTM) koje kontroliraju aktivnost proteina. OPA1 ima osam alternativnih varijanti splajsovanja koje se proteolitički cijepaju u mitohondrijama kako bi se proizvele dvije različite izoforme 63. Ravnoteža između dugih i kratkih izoformi u konačnici određuje ulogu OPA1 u mitohondrijskoj fuziji i održavanju mitohondrijalne mreže64. Aktivnost DRP1 regulirana je fosforilacijom protein kinaze II zavisne od kalcija/kalmodulina (CaMKII), dok je degradacija DRP1 regulirana ubikvitinacijom i SUMOilacijom65. Konačno, i DRP1 i MFN1/2 su GTPaze, tako da na aktivnost može utjecati brzina proizvodnje GTP-a u mitohondrijama 66. Stoga, iako ekspresija ovih proteina ostaje konstantna, to ne mora odražavati nepromijenjenu aktivnost ili lokalizaciju proteina 67,68. Zaista, postojeći repertoari PTM proteina često služe kao prva linija odbrane odgovorna za posredovanje akutnih stresnih odgovora. U prisustvu umjerenog metaboličkog stresa u našem modelu, vjerovatno je da PTM promovira povećanu aktivnost fuzijskih i fisijskih proteina kako bi se dovoljno obnovio integritet mitohondrija bez potrebe za dodatnom aktivacijom ovih gena na nivou mRNA ili proteina.
Uzeti zajedno, gore navedeni podaci ističu složenu i vremenski zavisnu regulaciju mitohondrijalne morfologije i izazove razjašnjavanja ovih mehanizama. Da bi se proučavala ekspresija gena, prvo je potrebno identificirati specifične ciljne gene u tom putu. Međutim, naši podaci pokazuju da geni u istom putu ne reagiraju na isti način na isti stres. U stvari, prethodne studije su pokazale da različiti geni u istom putu mogu pokazivati ​​različite profile vremenskog odgovora30,46. Osim toga, postoje složeni posttranskripcijski mehanizmi koji narušavaju odnos između transkripcije i funkcije gena. Proteomske studije mogu pružiti uvid u utjecaj PTM-ova i funkcije proteina, ali one također predstavljaju izazove, uključujući metode niskog protoka, visoke omjere signal-šum i lošu rezoluciju.
U ovom kontekstu, proučavanje mitohondrijalne morfologije pomoću TEM-a i MEL-a ima veliki potencijal za rješavanje fundamentalnih pitanja o odnosu između mitohondrijalne dinamike i funkcije i kako to utiče na bolest. Najvažnije je da TEM pruža direktnu metodu za mjerenje mitohondrijalne morfologije kao konvergentne krajnje tačke mitohondrijalne disfunkcije i dinamike51. MEL također pruža direktnu metodu za vizualizaciju događaja fisije i fuzije u trodimenzionalnom ćelijskom okruženju, omogućavajući kvantifikaciju dinamičkog mitohondrijalnog remodeliranja čak i u odsustvu promjena u ekspresiji gena33. Ovdje ističemo korisnost tehnika mitohondrijalnog snimanja kod sekundarnih mitohondrijalnih bolesti. Ove bolesti obično karakterizira hronični blagi metabolički stres koji karakterizira suptilno remodeliranje mitohondrijalnih mreža, a ne akutno mitohondrijalno oštećenje. Međutim, mitohondrijalna kompenzacija potrebna za održavanje mitoze pod hroničnim stresom ima duboke funkcionalne posljedice. U kontekstu neuroznanosti, bolje razumijevanje ovih kompenzacijskih mehanizama može pružiti važne informacije o pleiotropnoj neuropatologiji povezanoj s mitohondrijalnom disfunkcijom.
Konačno, naši podaci ističu korisnost tehnika snimanja za razumijevanje funkcionalnih posljedica složenih interakcija između ekspresije gena, modifikacija proteina i aktivnosti proteina koje kontroliraju dinamiku neuronskih mitohondrija. Koristili smo PPA za modeliranje mitohondrijalne disfunkcije u modelu neuronskih ćelija kako bismo stekli uvid u mitohondrijalnu komponentu ASD-a. SH-SY5Y ćelije tretirane PPA pokazale su promjene u mitohondrijskoj morfologiji: mitohondrije su postale male i okrugle, a kriste su bile slabo definirane kada su posmatrane TEM-om. MEL analiza pokazuje da se ove promjene javljaju istovremeno s povećanjem događaja fisije i fuzije kako bi se održala mitohondrijalna mreža kao odgovor na blagi metabolički stres. Štaviše, PPA značajno remeti transkripcijsku regulaciju mitohondrijalnog metabolizma i homeostaze. Identificirali smo cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 i OPA1 kao ključne mitohondrijalne regulatore poremećene PPA stresom i mogu igrati ulogu u posredovanju promjena u mitohondrijskoj morfologiji i funkciji izazvanih PPA. Potrebna su buduća istraživanja kako bi se bolje okarakterizirale PPA-inducirane vremenske promjene u ekspresiji gena i aktivnosti proteina, lokalizaciji i posttranslacijskim modifikacijama. Naši podaci ističu složenost i međuzavisnost regulatornih mehanizama koji posreduju u odgovoru mitohondrija na stres i pokazuju korisnost TEM-a i drugih tehnika snimanja za ciljanije mehanističke studije.
Ćelijska linija SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) je kupljena od Sigma-Aldrich. SH-SY5Y ćelije su uzgajane u Dulbeccoovom modificiranom Eagleovom mediju/F-12 nutrijentnoj smjesi (DMEM/F-12) i L-glutaminu (SC09411, ScienCell) u tikvicama od 25 cm2 dopunjenim sa 20% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) i 1% penicilin-streptomicina (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) na 37 °C, 5% CO2. Ćelije su subkultivirane do 80% konfluencije koristeći 0,05% tripsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugirane na 300 g i nasađene na gustoću od približno 7 × 105 ćelija/ml. Svi eksperimenti su provedeni na nediferenciranim SH-SY5Y ćelijama između pasaža 19-22. PPA se primjenjuje kao NaP. Rastvoriti NaP prah (CAS br. 137-40-6, hemijska formula C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) u toploj MilliQ vodi do koncentracije od 1 M i čuvati na 4 °C. Na dan tretmana, razrijediti ovaj rastvor sa 1 M PPA do 3 mM i 5 mM PPA u medijumu bez seruma (DMEM/F-12 sa L-glutaminom). Koncentracije tretmana za sve eksperimente bile su bez PPA (0 mM, kontrola), 3 mM i 5 mM PPA. Eksperimenti su provedeni u najmanje tri biološka ponavljanja.
SH-SY5Y ćelije su zasijane u tikvice od 25 cm5 brzinom od 5,5 × 105 ćelija/ml i uzgajane 24 sata. PPA tretman je dodan u tikvicu prije 24 sata inkubacije. Sakupite ćelijske pelete slijedeći normalne protokole za subkulturu tkiva sisara (opisane gore). Resuspendirajte ćelijske pelete u 100 µl 2,5% glutaraldehida, 1× PBS i čuvajte na 4 °C do obrade. SH-SY5Y ćelije su kratko centrifugirane kako bi se ćelije peletirale i uklonilo 2,5% glutaraldehida, 1× PBS rastvor. Resuspendirajte sediment u 4% agaroznom gelu pripremljenom u destilovanoj vodi (odnos agaroze i volumena sedimenta je 1:1). Komadići agaroze su postavljeni na rešetke na ravnim pločama i premazani 1-heksadecenom prije zamrzavanja pod visokim pritiskom. Uzorci su zamrznuti u 100% suhom acetonu na -90°C tokom 24 sata. Temperatura je zatim povišena na -80°C i dodan je rastvor od 1% osmijum tetroksida i 0,1% glutaraldehida. Uzorci su čuvani na -80°C tokom 24 sata. Nakon toga, temperatura je postepeno povećavana do sobne temperature tokom nekoliko dana: od –80°C do –50°C tokom 24 sata, do –30°C tokom 24 sata, do –10°C tokom 24 sata i konačno do sobne temperature.
Nakon kriogene pripreme, uzorci su impregnirani smolom i napravljeni su ultratanki rezovi (∼100 nm) korištenjem ultramikrotoma Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Rezovi su obojeni sa 2% uranil acetata i olovnog citrata. Uzorci su posmatrani korištenjem transmisionog elektronskog mikroskopa FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (ranije FEI), Eindhoven, Holandija) koji radi na 200 kV (Lab6 predajnik) i Gatan CCD kamere (Gatan, UK) opremljene Tridiem energetskim filterom.
U svakoj tehničkoj replikaciji, prikupljene su najmanje 24 slike pojedinačnih ćelija, za ukupno 266 slika. Sve slike su analizirane korištenjem makroa Region of Interest (ROI) i makroa Mitochondria. Mitohondrijski makro je zasnovan na objavljenim metodama17,31,32 i omogućava poluautomatsku grupnu obradu TEM slika u Fiji/ImageJ69. Ukratko: slika se invertuje i invertuje korištenjem oduzimanja pozadine kotrljajuće kuglice (radijus od 60 piksela) i FFT propusnog filtera (korištenjem gornje i donje granice od 60 i 8 piksela respektivno) i supresije vertikalnih linija s tolerancijom orijentacije od 5%. Obrađena slika se automatski postavlja na prag korištenjem algoritma maksimalne entropije i generira se binarna maska. Izdvojene su regije slike povezane s ručno odabranim ROI-ima u sirovim TEM slikama, karakterizirajući mitohondrije i isključujući plazma membranu i druge regije visokog kontrasta. Za svaki izdvojeni ROI, analizirane su binarne čestice veće od 600 piksela, a površina čestice, obim, glavne i sporedne ose, Feretov promjer, zaobljenost i kružnost su izmjereni korištenjem ugrađenih funkcija mjerenja Fiji/ImageJ-a. Slijedeći Merrill, Flippo i Strack (2017), površina 2, omjer stranica čestice (omjer glavne i sporedne ose) i faktor oblika (FF) izračunati su iz ovih podataka, gdje je FF = obim 2/4pi x površina. Definicija parametarske formule može se naći u Merrill, Flippo i Strack (2017). Spomenuti makroi dostupni su na GitHub-u (pogledajte Izjavu o dostupnosti podataka). U prosjeku je analizirano približno 5.600 čestica po PPA tretmanu, za ukupno približno 17.000 čestica (podaci nisu prikazani).
SH-SH5Y ćelije su smještene u posude za kulture sa 8 komora (ThermoFisher, #155411) kako bi se omogućila adhezija preko noći, a zatim su inkubirane sa TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) i Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Slike su dobijene korištenjem lasera od 405 nm i 561 nm tokom 10 minuta, a sirove slike su dobijene kao z-stackovi koji sadrže 10 mikrografija slike sa az korakom od 0,2 μm između kadrova slike u 12 uzastopnih vremenskih tačaka. Slike su prikupljene korištenjem Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 platforme super-rezolucije (Carl Zeiss, Oberkochen, Njemačka) korištenjem LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 sočiva. Slike su analizirane u ImageJ-u korištenjem prethodno opisanog cjevovoda i ImageJ dodatka za mjerenje događaja fuzije i fisije, prosječnog broja mitohondrijskih struktura i prosječnog mitohondrijskog volumena po ćeliji33. MEL makroi su dostupni na GitHub-u (pogledajte Izjavu o dostupnosti podataka).
SH-SY5Y ćelije su uzgajane u pločama sa šest jažica pri gustoći od 0,3 × 10⁶ ćelija/mL tokom 24 sata prije tretmana. RNK je ekstrahovana korištenjem Quick-RNA™ Miniprep protokola (ZR R1055, Zymo Research) uz male modifikacije: dodavanje 300 μl pufera za lizu RNK u svaku jažicu prije uklanjanja i lizacija svakog uzorka kao završni korak sa 30 μl vode bez DNase/RNase elucije. Svi uzorci su provjereni na količinu i kvalitet korištenjem NanoDrop ND-1000 UV-Vis spektrofotometra. Ukupni proteini iz ćelijskih lizata dobijeni su korištenjem 200 μl RIPA pufera za lizu, a koncentracija proteina je kvantificirana korištenjem Bradford protein testa70.
Sinteza cDNA je provedena korištenjem Tetro™ cDNA Synthesis Kit-a (BIO-65043, Meridian Bioscience) prema uputama proizvođača uz neke modifikacije. cDNA je sintetizirana u reakcijama od 20 μl korištenjem 0,7 do 1 μg ukupne RNK. Prajmeri su odabrani iz prethodno objavljenih radova 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabela S1), a prateće probe su dizajnirane korištenjem PrimerQuest alata od Integrated DNA Technologies. Svi geni od interesa su normalizovani na nuklearni B2M gen. Ekspresija gena STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC i OPA1 je mjerena RT-qPCR-om. Master mix je uključivao LUNA Taq polimerazu (M3003L, New England Biolabs), 10 μM forward i reverse prajmere, cDNA i vodu PCR-kvaliteta kako bi se dobio konačni volumen od 10 μL za svaku reakciju. Ekspresija gena diobe i fisije (DRP1, MFN1/2) mjerena je korištenjem TaqMan multipleks testova. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) korišten je prema uputama proizvođača uz manje izmjene. Multipleks RT-qPCR master mix uključuje 1X LUNA Taq polimerazu, 10 μM početne i povratne primere, 10 μM probu, cDNA i vodu PCR kvalitete, što je rezultiralo konačnim volumenom od 20 μL za svaku reakciju. RT-qPCR je proveden korištenjem Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - serijski broj: R0618110). Uslovi ciklusa prikazani su u Tabeli S1. Svi uzorci cDNA su amplificirani u tri primjerka, a standardna krivulja je generirana korištenjem serije desetostrukih razrjeđenja. Iz analize su uklonjene vrijednosti izvanrednih vrijednosti u tri primjerka sa standardnom devijacijom praga ciklusa (Ct) >0,5 kako bi se osigurala reproducibilnost podataka30,72. Relativna ekspresija gena izračunata je korištenjem 2-ΔΔCt79 metode.
Uzorci proteina (60 μg) su pomiješani sa Laemmlijevim puferom za punjenje u omjeru 2:1 i analizirani na 12% bezbojnom proteinskom gelu (Bio-Rad #1610184). Proteini su preneseni na PVDF (poliviniliden fluorid) membranu (#170-84156, Bio-Rad) korištenjem Trans-Blot Turbo sistema (#170-4155, Bio-Rad). Membrana je blokirana i inkubirana sa odgovarajućim primarnim antitijelima (OPA1, MFN1, MFN2 i DRP1) (razrijeđeno 1:1000) tokom 48 sati, nakon čega je uslijedila inkubacija sa sekundarnim antitijelima (1:10.000) tokom 1 sata. Membrane su zatim snimljene korištenjem Clarity Western ECL supstrata (#170-5061, Bio-Rad) i snimljene korištenjem Bio-Rad ChemiDoc MP sistema. Za Western blot analizu korišten je ImageLab verzija 6.1. Originalni gel i blot su prikazani na Slici S1. Informacije o antitijelima su date u Tabeli S2.
Skupovi podataka su predstavljeni kao srednja vrijednost i standardna greška srednje vrijednosti (SEM) najmanje tri nezavisna uzorka. Skupovi podataka su testirani na normalnost korištenjem Shapiro-Wilks testa (osim ako nije drugačije navedeno) prije nego što se pretpostavila Gaussova distribucija i jednake standardne devijacije i nastavilo s analizama. Pored analize skupa podataka, korištena je Fisherova MEL LSD (p < 0,05), jednosmjerna ANOVA (srednja vrijednost tretmana u odnosu na kontrolu) i Dunnettov test višestruke usporedbe za određivanje značajnosti (p < 0,05). Značajne p vrijednosti su prikazane na grafikonu kao *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Sve statističke analize i grafikoni su izvršeni i generirani korištenjem GraphPad Prism 9.4.0.
Fiji/ImageJ makroi za analizu TEM slika su javno dostupni na GitHub-u: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makro za lokator mitohondrijalnih događaja (MEL) je javno dostupan na GitHub-u: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM i Vijaya A. Mitohondrije: glavni regulatori metabolizma, homeostaze, stresa, starenja i epigenetike. Indonezijski. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Višestruka mitohondrijska disfunkcija kod shizofrenije, kompleks I kao moguća patološka meta. Šizofrenija. resurs. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. i Beal, MF Mitohondrijska disfunkcija kod Parkinsonove bolesti. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG i Mehta V. Stresne mitohondrije: mete invazije kod Alzheimerove bolesti. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF i Ferreira GK Mitohondrije i mozak: bioenergetika i više. Neurotoksini. resurs. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. i dr. Pleiotropne mitohondrije: utjecaj mitohondrija na razvoj neurona i bolesti. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. i Morais, VA Mitohondrijska biogeneza u neuronima: kako i gdje. međunarodnost. J. Mohr. nauka. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. i Zhao, J. Regulacija mitohondrijalne dinamike sisara: mogućnosti i izazovi. frontalni endokrini. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. i Slack, RS Mitohondrijska dinamika u regulaciji neurogeneze: od mozga u razvoju do odraslog mozga. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).