Sadašnjost *Trenutna adresa: Köln 50931, Njemačka, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
Neurodegeneracija mitohondrijskih bolesti smatra se ireverzibilnom jer je metabolička plastičnost neurona ograničena, ali je utjecaj mitohondrijske disfunkcije na autonomiju ćelija neuronskog metabolizma u tijelu slabo shvaćen. Ovdje predstavljamo ćelijski specifičan proteom Purkinjeovih neurona s progresivnim nedostatkom OXPHOS-a uzrokovanim poremećenom dinamikom mitohondrijalne fuzije. Otkrili smo da je mitohondrijalna disfunkcija izazvala duboku promjenu u području proteomike, što je na kraju dovelo do sekvencijalne aktivacije preciznih metaboličkih programa prije ćelijske smrti. Neočekivano, utvrdili smo očiglednu indukciju piruvat karboksilaze (PCx) i drugih enzima protiv starenja koji nadopunjuju međuprodukte TCA ciklusa. Inhibicija PCx pogoršala je oksidativni stres i neurodegeneraciju, što ukazuje na to da ateroskleroza ima zaštitni učinak na neurone kojima nedostaje OXPHOS. Obnova mitohondrijalne fuzije u terminalno degeneriranim neuronima potpuno poništava ove metaboličke karakteristike, čime se sprječava ćelijska smrt. Naši nalazi identificiraju prethodno nepoznate puteve koji daju otpornost mitohondrijskoj disfunkciji i pokazuju da se neurodegeneracija može poništiti čak i u kasnim fazama bolesti.
Centralna uloga mitohondrija u održavanju neuronskog energetskog metabolizma naglašena je opsežnim neurološkim simptomima povezanim s ljudskim mitohondrijskim bolestima. Većinu ovih bolesti uzrokuju genske mutacije koje reguliraju ekspresiju mitohondrijalnih gena (1, 2) ili uništavanje gena povezano s mitohondrijalnom dinamikom, što indirektno utječe na stabilnost mitohondrijalne DNK (mtDNK) (3, 4). Rad na životinjskim modelima pokazao je da se kao odgovor na mitohondrijalnu disfunkciju u okolnim tkivima mogu aktivirati konzervativni metabolički putevi (5-7), što pruža važne informacije za dublje razumijevanje patogeneze ovih složenih bolesti. Nasuprot tome, naše razumijevanje metaboličkih promjena specifičnih tipova ćelija uzrokovanih općim neuspjehom u proizvodnji mitohondrijalnog adenozin trifosfata (ATP) u mozgu je fundamentalno (8), naglašavajući potrebu za identifikacijom terapijskih ciljeva koji se mogu koristiti za sprječavanje ili prevenciju bolesti. Spriječiti neurodegeneraciju (9). Nedostatak informacija je činjenica da se smatra da nervne ćelije imaju vrlo ograničenu metaboličku fleksibilnost u usporedbi s tipovima ćelija okolnih tkiva (10). S obzirom na to da ove ćelije igraju centralnu ulogu u koordinaciji opskrbe metabolitima neuronima kako bi se promovirao sinaptički prijenos i odgovorilo na ozljede i bolesti, sposobnost prilagođavanja ćelijskog metabolizma izazovnim uvjetima moždanog tkiva gotovo je ograničena na glialne ćelije (11-14). Osim toga, inherentna ćelijska heterogenost moždanog tkiva uveliko ometa proučavanje metaboličkih promjena koje se javljaju u specifičnim neuronskim podgrupama. Kao rezultat toga, malo se zna o tačnim ćelijskim i metaboličkim posljedicama mitohondrijalne disfunkcije u neuronima.
Kako bismo razumjeli metaboličke posljedice mitohondrijalne disfunkcije, izolirali smo Purkinjeove neurone (PN) u različitim fazama neurodegeneracije uzrokovane uništavanjem fuzije vanjske membrane mitohondrija (Mfn2). Iako su mutacije Mfn2 kod ljudi povezane s oblikom nasljedne motorne senzorne neuropatije poznate kao Charcot-Marie-Tooth tip 2A (15), uvjetno uništavanje Mfn2 kod miševa je dobro poznata metoda indukcije oksidacijske fosforilacije (OXPHOS) disfunkcije. Različiti neuronski podtipovi (16-19) i rezultirajući neurodegenerativni fenotip praćeni su progresivnim neurološkim simptomima, kao što su poremećaji kretanja (18, 19) ili cerebelarna ataksija (16). Korištenjem kombinacije kvantitativne (LFQ) proteomike bez označavanja, metabolomike, slikovnih i viroloških metoda, pokazujemo da progresivna neurodegeneracija snažno inducira piruvat karboksilazu (PCx) i druge faktore uključene u arteriosklerozu PN-ova in vivo. Ekspresija enzima. Kako bismo provjerili relevantnost ovog nalaza, specifično smo smanjili ekspresiju PCx kod neuronuklearnih ćelija (PN) s nedostatkom Mfn2 i otkrili da ova operacija pogoršava oksidativni stres i ubrzava neurodegeneraciju, čime dokazujemo da azoospermija dovodi do metaboličke adaptivnosti ćelijske smrti. Teška ekspresija MFN2 može u potpunosti spasiti terminalnu degenerativnu PN s teškim nedostatkom OXPHOS-a, masivnom potrošnjom mitohondrijske DNK i očigledno prekinutom mitohondrijskom mrežom, što dodatno naglašava da se ovaj oblik neurodegeneracije može oporaviti čak i u uznapredovalom stadiju bolesti prije ćelijske smrti.
Kako bismo vizualizirali mitohondrije u PN-ima sa Mfn2 knockoutom, koristili smo soj miševa koji omogućava Cre-zavisnim mitohondrijama da ciljaju ekspresiju žutog fluorescentnog proteina (YFP) (mtYFP) (20) Cre i provjerili smo morfologiju mitohondrija in vivo. Otkrili smo da uništavanje Mfn2 gena u PN-ima dovodi do postepene diobe mitohondrijske mreže (Slika S1A), a najranija promjena je uočena u dobi od 3 sedmice. Nasuprot tome, značajna degeneracija sloja PN ćelija, što je dokazano gubitkom imunobojenja Calbindinom, nije počela do 12 sedmica starosti (Slika 1, A i B). Vremenska neusklađenost između najranijih promjena u morfologiji mitohondrija i vidljivog početka neuronske smrti potaknula nas je da istražimo metaboličke promjene izazvane mitohondrijalnom disfunkcijom prije ćelijske smrti. Razvili smo strategiju zasnovanu na sortiranju ćelija aktiviranih fluorescentnom aktivacijom (FACS) za izolaciju PN koje eksprimiraju YFP (YFP+) (Slika 1C), i kod kontrolnih miševa (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: :L7-cre), u daljem tekstu CTRL (Slika S1B). Optimizacija strategije zatvaranja zasnovana na relativnom intenzitetu YFP signala omogućava nam da pročistimo YFP+ tijelo (YFPhigh) PN od ne-PN (YFPneg) (Slika S1B) ili pretpostavljenih fluorescentnih aksonskih/dendritičnih fragmenata (YFPlow; Slika S1D, lijevo), što je potvrđeno konfokalnim mikroskopom (Slika S1D, desno). Kako bismo provjerili identitet klasifikovane populacije, proveli smo LFQ proteomiku, a zatim analizu glavnih komponenti i otkrili da postoji jasna razlika između YFPhigh i YFPneg ćelija (Slika S1C). YFPhigh ćelije su pokazale neto obogaćenje poznatih PN markera (npr. Calb1, Pcp2, Grid2 i Itpr3) (21, 22), ali ne i obogaćenje proteina koji se obično eksprimiraju u neuronima ili drugim tipovima ćelija (Slika 1D). Poređenje uzoraka u klasifikovanim YFPhigh ćelijama prikupljenim u nezavisnim eksperimentima pokazalo je koeficijent korelacije > 0,9, što pokazuje dobru reproducibilnost između bioloških replikata (Slika S1E). Ukratko, ovi podaci su potvrdili naš plan za akutnu i specifičnu izolaciju izvodljivih PN. Budući da korišteni L7-cre drajverski sistem indukuje mozaičnu rekombinaciju u prvoj sedmici nakon porođaja (23), počeli smo sa izlučivanjem miševa iz CTRL i uslovnim (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) sakupljanjem neurona. Nakon što je rekombinacija završena, to se naziva Mfn2cKO u starosti od 4 sedmice. Kao krajnju tačku, odabrali smo 8 sedmica starosti kada je PN sloj bio intaktan uprkos očiglednoj fragmentaciji mitohondrija (Slika 1B i Slika S1A). Ukupno smo kvantificirali ukupno 3013 proteina, od kojih je oko 22% bilo zasnovano na MitoCarta 2.0 anotacijama zasnovanim na mitohondrijalnom proteomu kao mitohondrijama (Slika 1E) (Slika 1E) (24). Analiza diferencijalne ekspresije gena provedena u 8. sedmici pokazala je da je samo 10,5% svih proteina imalo značajne promjene (Slika 1F i Slika S1F), od kojih je 195 proteina bilo smanjeno, a 120 proteina pojačano (Slika 1F). Vrijedi napomenuti da „analiza inovativnog puta“ ovog skupa podataka pokazuje da različito eksprimirani geni uglavnom pripadaju ograničenom skupu specifičnih metaboličkih puteva (Slika 1G). Zanimljivo je da, iako smanjenje regulacije puteva povezanih s OXPHOS i kalcijevom signalizacijom potvrđuje indukciju mitohondrijske disfunkcije u pulmonalnim neuronima s nedostatkom fuzije, druge kategorije koje uglavnom uključuju metabolizam aminokiselina značajno su pojačane, što je u skladu s metabolizmom koji se javlja u mitohondrijskim pulmonalnim neuronima. Rewiring je konzistentno.
(A) Reprezentativne konfokalne fotografije cerebelarnih presjeka CTRL i Mfn2cKO miševa koje pokazuju progresivni gubitak PN-ova (kalbindin, sivo); jezgre su kontrastno obojene sa DAPI. (B) Kvantifikacija (A) (jednosmjerna analiza varijanse, ***P<0,001; n = 4 do 6 krugova od tri miša). (C) Eksperimentalni tok rada. (D) Distribucija toplotne mape markera specifičnih za Purkinje (gore) i druge tipove ćelija (sredina). (E) Venov dijagram koji prikazuje broj mitohondrijskih proteina identifikovanih u klasifikovanoj PN. (F) Vulkanski dijagram različito eksprimiranih proteina u Mfn2cKO neuronima nakon 8 sedmica (granična vrijednost značajnosti od 1,3). (G) Analiza puta kreativnosti pokazuje pet najvažnijih puteva pojačane (crveno) i smanjene (plavo) regulacije u Mfn2cKO PN klasifikovanoj kao 8 sedmica. Prikazan je prosječni nivo ekspresije svakog detektovanog proteina. Toplinska mapa u sivim tonovima: prilagođena P vrijednost. ns, nije važno.
Proteomski podaci su pokazali da se ekspresija proteina kompleksa I, III i IV postepeno smanjivala. Kompleksi I, III i IV su svi sadržavali esencijalne mtDNK-kodirane podjedinice, dok je kompleks II, koji je bio samo nuklearno kodiran, u osnovi ostao nepromijenjen (Slika 2A i Slika S2A). U skladu s proteomskim rezultatima, imunohistokemija presjeka cerebelarnog tkiva pokazala je da se nivo MTCO1 (podjedinica 1 mitohondrijalne citokrom C oksidaze) kompleksa IV u PN postepeno smanjivao (Slika 2B). mtDNK-kodirana podjedinica Mtatp8 je značajno smanjena (Slika S2A), dok je nivo u stabilnom stanju nuklearno kodirane podjedinice ATP sintaze ostao nepromijenjen, što je u skladu s poznatim stabilnim kompleksom podsklopa ATP sintaze F1 kada je ekspresija mtDNK stabilna. Formiranje je konzistentno. Prekid (7). Evaluacija nivoa mtDNK u sortiranim Mfn2cKO PN-ovima pomoću lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (qPCR) potvrdila je postepeno smanjenje broja kopija mtDNK. U poređenju sa kontrolnom grupom, u dobi od 8 sedmica, zadržano je samo oko 20% nivoa mtDNK (Slika 2C). U skladu s ovim rezultatima, bojenje Mfn2cKO PN-ova konfokalnom mikroskopijom korišteno je za detekciju DNK, pokazujući vremenski zavisnu potrošnju mitohondrijskih nukleotida (Slika 2D). Otkrili smo da su samo neki kandidati uključeni u razgradnju mitohondrijskih proteina i odgovor na stres bili pojačano regulirani, uključujući Lonp1, Afg3l2 i Clpx, te faktore sklapanja OXPHOS kompleksa. Nisu otkrivene značajne promjene u nivoima proteina uključenih u apoptozu (Slika S2B). Slično tome, otkrili smo da mitohondrijski i endoplazmatski retikulumski kanali uključeni u transport kalcija imaju samo manje promjene (Slika S2C). Osim toga, evaluacija proteina povezanih s autofagijom nije pronašla značajne promjene, što je u skladu s vidljivom indukcijom autofagosoma uočenom in vivo imunohistokemijom i elektronskom mikroskopijom (Slika S3). Međutim, progresivna OXPHOS disfunkcija kod PN-ova praćena je očiglednim ultrastrukturnim mitohondrijskim promjenama. Mitohondrijski klasteri mogu se vidjeti u ćelijskim tijelima i dendritskim stablima Mfn2cKO PN starih 5 i 8 sedmica, a struktura unutrašnje membrane je pretrpjela značajne promjene (Slika S4, A i B). U skladu s ovim ultrastrukturnim promjenama i značajnim smanjenjem mtDNK, analiza akutnih cerebelarnih presjeka s tetrametilrodamin metil esterom (TMRM) pokazala je da je potencijal mitohondrijske membrane u Mfn2cKO PN značajno smanjen (Slika S4C).
(A) Vremenska analiza nivoa ekspresije OXPHOS kompleksa. Uzmite u obzir samo proteine ​​sa P<0,05 nakon 8 sedmica (dvosmjerna ANOVA). Isprekidana linija: Nema podešavanja u poređenju sa CTRL. (B) Lijevo: Primjer cerebelarnog presjeka označenog anti-MTCO1 antitijelom (skala, 20 μm). Područje koje zauzimaju Purkinje ćelijska tijela prekriveno je žutom bojom. Desno: Kvantifikacija nivoa MTCO1 (jednosmjerna analiza varijanse; n = 7 do 20 analiziranih ćelija od tri miša). (C) qPCR analiza broja kopija mtDNK u sortiranoj PN (jednosmjerna analiza varijanse; n = 3 do 7 miševa). (D) Lijevo: Primjer cerebelarnog presjeka označenog anti-DNK antitijelom (skala, 20 μm). Područje koje zauzimaju Purkinje ćelijska tijela prekriveno je žutom bojom. Desno: Kvantifikacija mtDNK lezija (jednosmjerna analiza varijanse; n = 5 do 9 ćelija od tri miša). (E) Primjer akutnog cerebelarnog presjeka koji prikazuje mitoYFP + Purkinjeove ćelije (strelica) u snimku cijelih ćelija metodom patch clamp. (F) Kvantifikacija IV krive. (G) Reprezentativni snimci injekcije depolarizirajuće struje u CTRL i Mfn2cKO Purkinjeovim ćelijama. Gornji trag: Prvi puls koji je pokrenuo AP. Donji trag: Maksimalna AP frekvencija. (H) Kvantifikacija postsinaptičkih spontanih unosa (sPSP). Reprezentativni trag snimka i njegov omjer zumiranja prikazani su u (I). Jednosmjerna analiza varijanse analizirala je n = 5 do 20 ćelija od tri miša. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Reprezentativni tragovi spontane AP snimljene korištenjem perforiranog patch clamp moda. Gornji trag: Maksimalna AP frekvencija. Donji trag: zumiranje jedne AP. (K) Kvantificirajte prosječnu i maksimalnu AP frekvenciju prema (J). Mann-Whitneyjev test; n = 5 ćelija je analizirano od četiri miša. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM; nije važno.
Očigledno oštećenje OXPHOS-a otkriveno je kod 8 sedmica stare Mfn2cKO PN, što ukazuje na to da je fiziološka funkcija neurona ozbiljno abnormalna. Stoga smo analizirali pasivne električne karakteristike neurona s nedostatkom OXPHOS-a u dobi od 4 do 5 sedmica i od 7 do 8 sedmica izvođenjem patch clamp snimanja cijelih ćelija u akutnim cerebelarnim presjecima (Slika 2E). Neočekivano, prosječni membranski potencijal mirovanja i ulazni otpor Mfn2cKO neurona bili su slični kontrolnoj grupi, iako su postojale suptilne razlike između ćelija (Tabela 1). Slično tome, u dobi od 4 do 5 sedmica nisu pronađene značajne promjene u odnosu struje i napona (IV krivulja) (Slika 2F). Međutim, nijedan Mfn2cKO neuron star 7 do 8 sedmica nije preživio IV režim (korak hiperpolarizacije), što ukazuje na to da postoji jasna osjetljivost na potencijal hiperpolarizacije u ovoj kasnoj fazi. Nasuprot tome, kod Mfn2cKO neurona, depolarizirajuće struje koje uzrokuju ponovljena pražnjenja akcionog potencijala (AP) su dobro podnošljive, što ukazuje na to da se njihovi ukupni obrasci pražnjenja ne razlikuju značajno od onih kod kontrolnih neurona starih 8 sedmica (Tabela 1 i Slika 2G). Slično tome, frekvencija i amplituda spontanih postsinaptičkih struja (sPSC) bile su uporedive sa onima kod kontrolne grupe, a učestalost događaja se povećala sa 4 sedmice na 5 sedmica na 7 sedmica na 8 sedmica sa sličnim povećanjem (Slika 2, H i I). Period sinaptičkog sazrijevanja u PN (25). Slični rezultati su dobijeni nakon perforiranih PN flastera. Ova konfiguracija sprečava moguću kompenzaciju defekata ćelijskog ATP-a, kao što bi se moglo dogoditi kod snimanja clamp flasterom cijelih ćelija. Konkretno, potencijal membrane u mirovanju i frekvencija spontanog paljenja Mfn2cKO neurona nisu bili pogođeni (Slika 2, J i K). Ukratko, ovi rezultati ukazuju na to da se PN-ovi s očiglednom OXPHOS disfunkcijom mogu dobro nositi s visokofrekventnim obrascima pražnjenja, što ukazuje na to da postoji kompenzacijski mehanizam koji im omogućava održavanje gotovo normalnih elektrofizioloških odgovora.
Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM (jednosmjerna analiza varijanse, Holm-Sidakov test višestruke usporedbe; *P<0,05). Broj jedinice je označen zagradama.
Krenuli smo istražiti da li bilo koja kategorija u proteomskom skupu podataka (Slika 1G) uključuje puteve koji mogu suzbiti teški nedostatak OXPHOS-a, čime se objašnjava zašto pogođena PN može održati gotovo normalnu elektrofiziologiju (Slika 2, E do K). Proteomska analiza pokazala je da su enzimi uključeni u katabolizam aminokiselina razgranatog lanca (BCAA) značajno pojačani (Slika 3A i Slika S5A), a konačni produkt acetil-CoA (CoA) ili sukcinil CoA mogu nadopuniti trikarboksilate u ciklusu arteriosklerozne kiseline (TCA). Otkrili smo da se sadržaj BCAA transaminaze 1 (BCAT1) i BCAT2 povećao. One kataliziraju prvi korak katabolizma BCAA stvaranjem glutamata iz α-ketoglutarata (26). Sve podjedinice koje čine kompleks ketokiselina dehidrogenaze razgranatog lanca (BCKD) su pojačano regulirane (kompleks katalizira naknadnu i ireverzibilnu dekarboksilaciju rezultirajućeg ugljikovog skeleta BCAA) (Slika 3A i Slika S5A). Međutim, nisu pronađene očigledne promjene u samoj BCAA u sortiranoj PN, što može biti posljedica povećanog ćelijskog unosa ovih esencijalnih aminokiselina ili upotrebe drugih izvora (glukoze ili mliječne kiseline) za dopunu TCA ciklusa (Slika S5B). PN kojima nedostaje OXPHOS također su pokazale povećanu aktivnost razgradnje i transaminacije glutamina u dobi od 8 sedmica, što se može odraziti pojačanom regulacijom mitohondrijskih enzima glutaminaze (GLS) i glutamin piruvat transaminaze 2 (GPT2) (Slika 3, A i C). Vrijedi napomenuti da je pojačana regulacija GLS ograničena na spojenu izoformu glutaminaze C (GLS-GAC) (promjena Mfn2cKO/CTRL je približno 4,5 puta veća, P = 0,05), a njena specifična pojačana regulacija u tkivima raka može podržati mitohondrijalnu bioenergiju. (27)
(A) Toplotna mapa prikazuje promjenu nivoa proteina za određeni put nakon 8 sedmica. (B) Primjer cerebelarnog kriške označenog anti-PCx antitijelom (skala, 20 μm). Žuta strelica pokazuje na tijelo Purkinjeovih ćelija. (C) Analiza vremenskog toka ekspresije proteina identifikovana kao važan kandidat za aterosklerozu (višestruki t-test, *FDR <5%; n = 3-5 miševa). (D) Iznad: Shematski dijagram koji prikazuje različite načine ulaska označenog ugljika sadržanog u traseru [1-13C]piruvat (tj. putem PDH ili transarterijskog puta). Dolje: Grafikon violine prikazuje procenat jednostruko označenog ugljika (M1) pretvorenog u asparaginsku kiselinu, limunsku kiselinu i jabučnu kiselinu nakon označavanja akutnih cerebelarnih kriški sa [1-13C]piruvatom (parni t-test; ** P <0,01). (E) Sveobuhvatna analiza vremenskog toka naznačenog puta. Uzmite u obzir samo proteine ​​sa P <0,05 nakon 8 sedmica. Isprekidana linija: nema vrijednosti prilagođavanja (dvosmjerna analiza varijanse; * P <0,05; *** P <0,001). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM.
U našoj analizi, katabolizam BCAA postao je jedan od ključnih puteva povećane regulacije. Ova činjenica snažno ukazuje na to da se volumen ventilacije koji ulazi u ciklus TCA može promijeniti kod neuronskih ćelija kojima nedostaje OXPHOS. Ovo može predstavljati glavni oblik neuronskog metaboličkog preoblikovanja, što može imati direktan uticaj na neuronsku fiziologiju i preživljavanje tokom održavanja teške OXPHOS disfunkcije. U skladu s ovom hipotezom, otkrili smo da je glavni antiaterosklerotski enzim PCx pojačano regulisan (Mfn2cKO/CTRL se mijenja približno 1,5 puta; Slika 3A), što katalizira konverziju piruvata u oksaloacetat (28), za koji se vjeruje da se nalazi u moždanom tkivu. Ekspresija je ograničena na astrocite (29, 30). U skladu s rezultatima proteomike, konfokalna mikroskopija je pokazala da je ekspresija PCx specifično i značajno povećana kod neuronskih ćelija kojima nedostaje OXPHOS, dok je reaktivnost PCx uglavnom ograničena na susjedne Bergmannove glialne ćelije kontrole (Slika 3B). Kako bismo funkcionalno testirali uočenu pojačanu regulaciju PCx, tretirali smo akutne cerebelarne kriške sa [1-13C]piruvat traserom. Kada je piruvat oksidiran piruvat dehidrogenazom (PDH), njegova izotopska oznaka je nestala, ali se ugrađuje u međuprodukte TCA ciklusa kada se piruvat metabolizira vaskularnim reakcijama (Slika 3D). Kao podršku našim proteomskim podacima, uočili smo veliki broj markera iz ovog trasera u asparaginskoj kiselini kriški Mfn2cKO, dok su limunska i jabučna kiselina također imale umjeren trend, iako ne značajan (Slika 3D).
U dopaminskim neuronima MitoPark miševa s mitohondrijalnom disfunkcijom uzrokovanom dopaminskim neuronima koji specifično uništavaju gen mitohondrijskog transkripcijskog faktora A (Tfam) (Slika S6B), ekspresija PCx je također bila značajno povišena (31), što ukazuje na acetonsku kiselinu kao arteriosklerozu. Pojava bolesti je regulirana tokom disfunkcije neuronskog OXPHOS-a u tijelu. Vrijedi napomenuti da je otkriveno da su jedinstveni enzimi (32-34) koji se mogu eksprimirati u neuronima koji mogu biti povezani s arteriosklerozom značajno povišeni u neuronima kojima nedostaje OXPHOS, kao što su propionil-CoA karboksilaza (PCC-A), malonil-CoA pretvara propionil-CoA u sukcinil-CoA i mitohondrijski jabučni enzim 3 (ME3), čija je glavna uloga izdvajanje piruvata iz malata (Slika 3, A i C) (33, 35). Osim toga, otkrili smo značajno povećanje enzima Pdk3, koji fosforilira i na taj način inaktivira PDH (36), dok nisu uočene promjene u enzimu Pdp1 koji aktivira PDH ili samom kompleksu enzima PDH (Slika 3A). Shodno tome, kod Mern2cKO PN, fosforilacija α1 podjedinice α (PDHE1α) podjedinice piruvat dehidrogenaze E1 komponente PDH kompleksa u Ser293 (poznato da inhibira enzimsku aktivnost PDH) bila je pojačana (Slika S6C) (Slika S6C). Piruvat nema vaskularni pristup.
Konačno, otkrili smo da su super put biosinteze serina i glicina, povezani mitohondrijski folatni (1C) ciklus i biosinteza prolina (Slika 1G i Slika S5C) značajno pojačani, prema izvještajima, tokom procesa aktivacije. Okolna tkiva se aktiviraju mitohondrijalnom disfunkcijom (5-7). Konfokalna analiza koja podržava ove proteomske podatke pokazala je da su kod PN sa nedostajućim OXPHOS-om, cerebelarni rezovi miševa starih 8 sedmica bili podvrgnuti serin hidroksimetiltransferazi 2 (SHMT2), ključnom enzimu mitohondrijskog folatnog ciklusa. Značajan imunološki odgovor (Slika S5D). U 13 akutnih cerebelarnih rezova inkubiranih sa CU-glukozom, eksperimenti metaboličkog praćenja dodatno su potvrdili pojačanu regulaciju biosinteze serina i prolina, što ukazuje na povećanje fluksa izoformi ugljika u serin i prolin (Slika S5E). Budući da su reakcije koje potiču GLS i GPT2 odgovorne za sintezu glutamata iz glutamina i transaminaciju između glutamata i α-ketoglutarata, njihova pojačana regulacija ukazuje na to da neuroni s nedostatkom OXPHOS-a imaju povećanu potrebu za glutamatom. Ovo može biti usmjereno na održavanje povećane biosinteze prolina (Slika S5C). Za razliku od ovih promjena, proteomska analiza cerebelarnih astrocita iz PN-specifičnih Mfn2cKO miševa pokazala je da se ovi putevi (uključujući sve antiperoksidaze) nisu značajno promijenili u ekspresiji, što pokazuje da je ovo metaboličko preusmjeravanje selektivno za degradirani PN (Slika S6, D do G).
Ukratko, ove analize su otkrile značajno različite obrasce vremenske aktivacije specifičnih metaboličkih puteva kod neuronskih neurona. Iako abnormalna neuronska mitohondrijska funkcija može dovesti do rane ateroskleroze i remodeliranja 1C (Slika 3E i Slika S5C), pa čak i predvidljivih promjena u ekspresiji I i IV kompleksa, promjene u de novo sintezi serina su tek postale očigledne u kasnim fazama. OXPHOS disfunkcija (Slika 3E i Slika S5C). Ovi nalazi definiraju sekvencijalni proces u kojem stresom izazvani mitohondrijski (1C ciklus) i citoplazmatski (biosinteza serina) organi sinergistički reagiraju s povećanjem ateroskleroze u TCA ciklusu kako bi preoblikovali neuronski metabolizam.
8 sedmica stare OXPHOS-deficitne PN ćelije mogu održavati aktivnost visokofrekventne ekscitacije i proći kroz značajno metaboličko ponovno povezivanje kako bi kompenzirale mitohondrijalnu disfunkciju. Ovo otkriće otvara zanimljivu mogućnost da čak i u ovom trenutku ove ćelije mogu primiti terapijsku intervenciju kako bi se odgodila ili spriječila neurodegeneracija. Kasno. Ovu mogućnost smo riješili kroz dvije nezavisne intervencije. U prvoj metodi, dizajnirali smo vektor Cre-zavisnog adeno-asociranog virusa (AAV) tako da se MFN2 može selektivno eksprimirati u OXPHOS-deficitnim PN ćelijama in vivo (Slika S7A). AAV koji kodira MFN2 i fluorescentni reporterski gen mCherry (Mfn2-AAV) su verificirani u primarnim neuronskim kulturama in vitro, što je uzrokovalo ekspresiju MFN2 na Cre-zavisan način i spasilo mitohondrijalnu morfologiju, čime se spriječila neuromutacija u Mfn2cKO neuronima (Slika S7, B, D i E). Zatim smo proveli in vivo eksperimente stereotaktičke isporuke 8 sedmica starog Mfn2-AAV u cerebelarni korteks Mfn2cKO i kontrolnih miševa, te analizirali 12 sedmica stare miševe (Slika 4A). Tretirani Mfn2cKO miševi su uginuli (Slika 1, A i B) (16). Virusna transdukcija in vivo rezultirala je selektivnom ekspresijom PN u nekim cerebelarnim krugovima (Slika S7, G i H). Injekcija kontrolnog AAV-a koji eksprimira samo mCherry (Ctrl-AAV) nije imala značajan utjecaj na stepen neurodegeneracije kod Mfn2cKO životinja. Nasuprot tome, analiza Mfn2cKO transduciranih s Mfn2-AAV pokazala je značajan zaštitni učinak PN ćelijskog sloja (Slika 4, B i C). Konkretno, gustoća neurona čini se gotovo nerazlučivom od kontrolnih životinja (Slika 4, B i C, te Slika S7, H i I). Ekspresija MFN1, ali ne i MFN2, podjednako je efikasna u sprečavanju neuronske smrti (Slika 4C i Slika S7, C i F), što ukazuje na to da ekspresija ektopičnog MFN1 može efikasno nadoknaditi nedostatak MFN2. Dalja analiza na nivou pojedinačne PN pokazala je da je Mfn2-AAV uglavnom spasio ultrastrukturu mitohondrija, normalizirao nivoe mtDNK i preokrenuo visoku ekspresiju markera anti-angiogeneze PCx ​​(Slika 4, C do E). Vizuelni pregled spašenih Mfn2cKO miševa u stanju mirovanja pokazao je da su im se poboljšali postura i motorički simptomi (pokret S1 do S3). Zaključno, ovi eksperimenti pokazuju da je odgođeno ponovno uvođenje MFN2 u PN sa ozbiljnim deficitom OXPHOS-a dovoljno da preokrene potrošnju mtDNK i izazove aterosklerozu, čime se sprječava degeneracija aksona i neuronska smrt in vivo.
(A) Shema koja prikazuje eksperimentalni raspored za injektiranje AAV-a koji kodira MFN2 kada je naznačeni metabolički put aktiviran. (B) Reprezentativne konfokalne slike 12 sedmica starih cerebelarnih presjeka transduciranih u 8 sedmica kod Mfn2cKO miševa i obilježenih anti-Calbindin antitijelom. Desno: Skaliranje aksonskih vlakana. Skala zumiranja aksona je 450 i 75 μm. (C) Lijevo: Kvantifikacija gustoće Purkinjeovih ćelija u AAV transdukcijskoj petlji (AAV+) (jednosmjerna analiza varijanse; n = 3 miša). Desno: analiza fokusa mtDNK u transduciranoj PN u 12. sedmici (nespareni t-test; n = 6 ćelija od tri miša). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Reprezentativne transmisijske elektronske mikrografije PN-ova Mfn2cKO cerebelarnih presjeka transduciranih naznačenim virusnim vektorima. Ružičasta maska ​​ilustruje površinu koju zauzimaju dendriti, a žuti isprekidani kvadrat ilustruje zumiranje s desne strane; n predstavlja jezgro. Mjerna traka, 1 μm. (E) prikazuje primjer PCx ​​bojenja u PN transduciranoj nakon 12 sedmica. Mjerna traka, 20 μm. OE, prekomjerna ekspresija; FC, promjena udjela.
Konačno, istražili smo važnost preživljavanja ćelija indukovanih peroksidazom kod PN koje su iskusile OXPHOS disfunkciju. Generisali smo mCherry koji kodira AAV-shRNA (RNA kratkih ukosnica) specifično ciljajući mišju PCx mRNA (AAV-shPCx) i injektirali virus ili njegovu pomiješanu kontrolu (AAV-scr) u mali mozak Mfn2cKO miševa. Injekcija je izvršena u četvrtoj sedmici starosti (Slika 5A) kako bi se postiglo efikasno smanjenje PCx tokom perioda kada je ekspresija PCx povećana (Slika 3C), a sloj PN ćelija još uvijek bio netaknut (Slika 1A). Vrijedi napomenuti da smanjenje PCx (Slika S8A) dovodi do značajnog ubrzanja PN smrti, koja je ograničena na zaraženi prsten (Slika 5, B i C). Kako bismo razumjeli mehanizam metaboličkih efekata izazvanih pojačanom regulacijom PCx, proučavali smo redoks status PN-ova nakon što su PCx ​​knockdown i AAV-posredovani optički biosenzor Grx1-roGFP2 istovremeno eksprimirani (Slika S8, B do D) kako bismo procijenili relativnu promjenu redoks potencijala peptida glutationa (38). Zatim smo izvršili dvofotonsku fluorescentnu slikovnu mikroskopiju tokom cijelog života (FLIM) u akutnim presjecima mozga 7 sedmica starih Mfn2cKO ili kontrolnih jedinki iz legla kako bismo otkrili potencijalne promjene u citoplazmatskom redoks statusu nakon provjere FLIM uslova (Slika S8, E do G). Analiza je pokazala značajno povećanje oksidacijskog stanja pojedinačnih Mfn2cKO PN-ova kojima nedostaje ekspresija PCx, što se razlikuje od kontrolnih neurona ili Mfn2cKO PN-ova koji eksprimiraju samo izmiješane shRNA (Slika 5, D i E). Kada je ekspresija PCx smanjena, procenat Mfn2cKO PN-ova koji pokazuju visoko oksidovano stanje povećao se za više od tri puta (Slika 5E), što ukazuje da je pojačana regulacija PCx održala redoks kapacitet degenerisanih neurona.
(A) Shema koja prikazuje eksperimentalni raspored za injektiranje AAV koji kodira shPCx kada je naznačeni metabolički put aktiviran. (B) Reprezentativne konfokalne fotografije 8 sedmica starih cerebelarnih presjeka kod Mfn2cKO miševa transduciranih i obilježenih anti-kalcineurin antitijelom nakon 4 sedmice. Mjerna skala, 450μm. (C) Kvantifikacija gustoće Purkinje ćelija u AAV-transduciranim petljama (jednosmjerna analiza varijanse; n = 3 do 4 miša). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM; ***P<0,001. (D) Reprezentativna FLIM slika prikazuje prosječni životni vijek 7 sedmica starih PN koje eksprimiraju glutation redoks senzor Grx1-roGFP2 pod određenim eksperimentalnim uslovima. LUT (look-up table) omjer: vremenski interval preživljavanja (u pikosekundama). Mjerna skala, 25μm. (E) Histogram prikazuje distribuciju vrijednosti životnog vijeka Grx1-roGFP2 iz (D) (n=158 do 368 ćelija kod dva miša pod svakim uslovom). Kružni dijagram iznad svakog histograma: prikazuje broj ćelija sa značajno dužim (crvena, oksidirana) ili kraćim (plava, smanjena) vrijednostima životnog vijeka, koje prelaze 1 SD prosječne vrijednosti životnog vijeka u CTRL-AAV-scr. (F) Predloženi model pokazuje zaštitni efekat pojačane regulacije neuronskog PCx.
Sve u svemu, podaci koje ovdje pružamo pokazuju da ponovna ekspresija MFN2 može u potpunosti spasiti uznapredovalu PN sa teškim nedostatkom OXPHOS-a, teškim iscrpljivanjem mtDNK i izuzetno abnormalnom ista-sličnom morfologijom, čime se osigurava kontinuirani napredak čak i kod uznapredovalih bolesti. Neurodegeneracija pruža reverzibilne dokaze o stadiju prije ćelijske smrti. Ovaj stepen metaboličke fleksibilnosti dodatno je naglašen sposobnošću neurona da indukuju aterosklerozu (preoblikovanje TCA ciklusa), što inhibira ekspresiju PCx u PN-ima kojima nedostaje OXPHOS i pojačava ćelijsku smrt, čime igra zaštitnu ulogu (Slika 5F).
U ovoj studiji pružili smo dokaze da je odgovor neurona (PN) na disfunkciju OXPHOS-a postepena konvergija ka aterosklerozi TCA ciklusa putem diferencijalnog aktivacijskog puta aktiviranog metaboličkim programima. Potvrdili smo proteomsku analizu mnogim komplementarnim metodama i otkrili da, kada su izazvani teškom mitohondrijalnom disfunkcijom, neuroni imaju prethodno nepoznat oblik metaboličke elastičnosti. Na naše iznenađenje, cijeli proces ponovnog ožičenja ne označava nužno terminalno metaboličko stanje koje postepeno i nepovratno prati neurodegeneraciju, ali naši podaci sugeriraju da on može predstavljati neuron za održavanje čak i u fazi prije ćelijske smrti. Mehanizam funkcionalne kompenzacije. Ovo otkriće ukazuje na to da neuroni imaju značajan stepen metaboličke plastičnosti u tijelu. Ova činjenica dokazuje da kasnije ponovno uvođenje MFN2 može preokrenuti ekspresiju ključnih metaboličkih markera i spriječiti degeneraciju PN-a. Naprotiv, inhibira aterosklerozu i ubrzava nervni sistem. transseksualac.
Jedan od najfascinantnijih nalaza u našem istraživanju je da PN-ovi kojima nedostaje OXPHOS mogu modificirati metabolizam TCA ciklusa pojačavanjem enzima koji specifično stimulišu arteriosklerozu. Metaboličko preuređenje je uobičajena karakteristika ćelija raka, od kojih se neke oslanjaju na glutamin kao dopunu međuproduktima TCA ciklusa kako bi proizvele redukcijske ekvivalente, koji pokreću respiratorni lanac i održavaju proizvodnju prekursora biosinteze lipida i nukleotida (39, 40). Nedavna studija je pokazala da je u perifernim tkivima koja doživljavaju disfunkciju OXPHOS-a, ponovno povezivanje metabolizma glutamina/glutamata također istaknuta karakteristika (5, 41), gdje smjer ulaska glutamina u TCA ciklus zavisi od težine OXPHOS povrede (41). Međutim, nedostaju jasni dokazi o bilo kakvoj sličnosti neuronske metaboličke plastičnosti u tijelu i njenoj mogućoj relevantnosti u kontekstu bolesti. U nedavnoj in vitro studiji, pokazano je da primarni kortikalni neuroni mobiliziraju bazene glutamata za neurotransmisiju, čime promoviraju oksidativni metabolizam i aterosklerozu u uslovima metaboličkog stresa (42). Vrijedi napomenuti da se pod farmakološkom inhibicijom enzima sukcinat dehidrogenaze TCA ciklusa, smatra da karboksilacija piruvata održava sintezu oksaloacetata u kultiviranim neuronima cerebelarnih granula (34). Međutim, fiziološka relevantnost ovih mehanizama za moždano tkivo (gdje se vjeruje da je ateroskleroza uglavnom ograničena na astrocite) i dalje ima važan fiziološki značaj (43). U ovom slučaju, naši podaci pokazuju da se PN oštećeni OXPHOS-om u tijelu mogu prebaciti na degradaciju BCAA i karboksilaciju piruvata, što su dva glavna izvora suplementacije intermedijara TCA fonda. Iako je predložen navodni doprinos katabolizma BCAA metabolizmu neuronske energije, pored uloge glutamata i GABA za neurotransmisiju (44), još uvijek nema dokaza za ove mehanizme in vivo. Stoga je lako nagađati da disfunkcionalni PN-ovi mogu automatski kompenzirati potrošnju TCA intermedijara potaknutu procesom asimilacije povećanjem ateroskleroze. Posebno, pojačana regulacija PCx može biti potrebna za održavanje povećane potražnje za asparaginskom kiselinom, što se sugerira kod proliferirajućih ćelija s mitohondrijalnom disfunkcijom (45). Međutim, naša metabolomska analiza nije otkrila nikakve značajne promjene u stabilnom stanju nivoa asparaginske kiseline u Mfn2cKO PN-ima (Slika S6A), što vjerovatno odražava različitu metaboličku iskorištavanje asparaginske kiseline između proliferirajućih ćelija i postmitotičkih neurona. Iako tačan mehanizam pojačane regulacije PCx u disfunkcionalnim neuronima in vivo tek treba da se okarakteriše, pokazali smo da ovaj preuranjeni odgovor igra važnu ulogu u održavanju redoks stanja neurona, što je demonstrirano u FLIM eksperimentima na cerebelarnim kriškama. Posebno, sprečavanje PN-ova da pojačano regulišu PCx može dovesti do oksidovanijeg stanja i ubrzati ćelijsku smrt. Aktivacija degradacije BCAA i karboksilacija piruvata nisu načini za karakterizaciju perifernih tkiva mitohondrijalne disfunkcije (7). Stoga se čini da su prioritetna karakteristika neurona s nedostatkom OXPHOS-a, čak i ako ne i jedina karakteristika, koja je važna za neurodegeneraciju. .
Cerebelarna bolest je heterogeni tip neurodegenerativne bolesti koja se obično manifestuje kao ataksija i često oštećuje PN (46). Ova populacija neurona je posebno osjetljiva na mitohondrijalnu disfunkciju jer je njihova selektivna degeneracija kod miševa dovoljna da reprodukuje mnoge motoričke simptome koji karakteriziraju ljudsku spinocerebelarnu ataksiju (16, 47, 48). Prema izvještajima, transgeni model miša s mutiranim genom povezan je s ljudskom spinocerebelarnom ataksijom i ima mitohondrijalnu disfunkciju (49, 50), što naglašava važnost proučavanja posljedica nedostatka OXPHOS-a kod PNPH. Stoga je posebno pogodno efikasno izolovati i proučavati ovu jedinstvenu populaciju neurona. Međutim, s obzirom na to da su PN vrlo osjetljive na pritisak i čine mali udio ukupne populacije cerebelarnih ćelija, za mnoge omik studije, selektivno odvajanje istih kao cijelih ćelija i dalje predstavlja izazovan aspekt. Iako je gotovo nemoguće postići apsolutni nedostatak kontaminacije drugih tipova ćelija (posebno tkiva odraslih), kombinovali smo efikasan korak disocijacije sa FACS-om kako bismo dobili dovoljan broj održivih neurona za nizvodnu proteomsku analizu i imali prilično visoku pokrivenost proteinima (oko 3000 proteina) u poređenju sa postojećim skupom podataka o cijelom malom mozgu (51). Očuvanjem održivosti cijelih ćelija, metoda koju ovdje pružamo omogućava nam ne samo da provjerimo promjene u metaboličkim putevima u mitohondrijama, već i da provjerimo promjene u njihovim citoplazmatskim ekvivalentima, što dopunjuje upotrebu oznaka mitohondrijske membrane za obogaćivanje tipa ćelija. Nova metoda za određivanje broja mitohondrija u složenim tkivima (52, 53). Metoda koju opisujemo nije povezana samo sa proučavanjem Purkinjeovih ćelija, već se može lako primijeniti na bilo koji tip ćelije kako bi se riješile metaboličke promjene u oboljelim mozgovima, uključujući i druge modele mitohondrijalne disfunkcije.
Konačno, identificirali smo terapijski prozor tokom ovog procesa metaboličkog preuređenja koji može potpuno preokrenuti ključne znakove ćelijskog stresa i spriječiti neuronsku degeneraciju. Stoga, razumijevanje funkcionalnih implikacija ovdje opisanog preuređenja može pružiti fundamentalni uvid u moguće tretmane za održavanje neuronske održivosti tokom mitohondrijalne disfunkcije. Potrebna su buduća istraživanja usmjerena na analizu promjena u energetskom metabolizmu u drugim tipovima moždanih ćelija kako bi se u potpunosti otkrila primjenjivost ovog principa na druge neurološke bolesti.
MitoPark miševi su prethodno opisani (31). C57BL/6N miševi sa loxP genima koji okružuju Mfn2 su prethodno opisani (18) i ukršteni sa L7-Cre miševima (23). Dobiveni dvostruko heterozigotni potomci su zatim ukršteni sa homozigotnim Mfn2loxP/Mfn2loxP miševima kako bi se generisali Purkinje-specifični nokauti gena za Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). U podskupini parenja, alel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) je uveden dodatnim ukrštanjima (20). Svi postupci na životinjama su provedeni u skladu sa evropskim, nacionalnim i institucionalnim smjernicama i odobreni od strane LandesamtfürNatur of Umwelt i Verbraucherschutz, Sjeverna Rajna-Vestfalija, Njemačka. Rad na životinjama takođe prati smjernice Evropske federacije udruženja za nauku o laboratorijskim životinjama.
Nakon anestezije cervikalne dislokacije trudnice, izolovan je mišji embrij (E13). Korteks je diseciran u Hanksovom uravnoteženom rastvoru soli (HBSS) dopunjenom sa 10 mM Hepesa i stavljen na Dulbeccoov modificirani Eagleov medij koji sadrži papain (20 U/ml) i cistein (1μg/ml). Tkivo je inkubirano u DMEM-u (1Ml) i disocirano enzimskom digestijom na 37°C tokom 20 minuta, a zatim mehanički samljeveno u DMEM-u dopunjenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma. Ćelije su zasijane na pokrovna stakalca obložena polilizinom u gustoći od 2×10⁶ po posudi za kulturu od 6 cm ili u gustoći od 0,5×10⁶ ćelija/cm² za analizu snimanja. Nakon 4 sata, medij je zamijenjen Neurobazalnim medijem bez seruma koji sadrži 1% dodatka B27 i 0,5 mM GlutaMax-a. Neuroni su zatim održavani na 37°C i 5% CO2 tokom cijelog eksperimenta, te su hranjeni jednom sedmično. Kako bi se indukovala rekombinacija in vitro, 3 μl (posuda za kulturu sa 24 jažice) ili 0,5 μl (ploča sa 24 jažice) sljedećeg AAV9 virusnog vektora korišteno je za tretiranje neurona drugog dana in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, kataloški broj 105530-AAV9) i AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, kataloški broj 105545-AAV9).
Komplementarna DNK mišjeg Mfn1 i Mfn2 (dobivena iz Addgene plazmida #23212 i #23213, respektivno) označena je V5 sekvencom (GKPIPNPLLGLDST) na C-terminusu i spojena je sa mCherry u okviru preko T2A sekvence. Grx1-roGFP2 je poklon od Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Zamjenom tdTomato kasete korištenjem konvencionalnih metoda kloniranja, kaseta je subklonirana u pAAV-CAG-FLEX-tdTomato okosnicu (Addgene referentni broj 28306) kako bi se generirali vektori pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 i pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Slična strategija je korištena za generiranje kontrolnog vektora pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Da bi se generirao AAV-shPCx konstrukt, potreban je plazmidni AAV vektor (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx-[shRNA#1]), koji sadrži DNK sekvencu koja kodira shRNA usmjerenu na mišji PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Pod kontrolom U6 promotora, koristi se mCherry pod kontrolom CMV promotora. Proizvodnja pomoćnih AAV vektora provedena je prema uputama proizvođača (Cell Biolabs). Ukratko, koristite transfer plazmid koji nosi mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) za privremenu transfekciju 293AAV ćelija - T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ili Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), kao i kodirajući AAV1 kapsidni protein i pomoćni protein. Plazmid za pakovanje, koristeći metodu kalcijum fosfata. Supernatant sirovog virusa je dobijen ciklusima zamrzavanja i odmrzavanja u kupki sa suvim ledom/etanolom i liziranim ćelijama u fosfatno puferovanom rastvoru soli (PBS). Vektor AAV je pročišćen diskontinuiranom ultracentrifugacijom s gradijentom jodiksanola (24 sata na 32.000 o/min i 4°C) i koncentriran korištenjem centrifugalnog filtera Amicon ultra-15. Genomski titar AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 kopija genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX je kao što je prethodno opisano (54), mjeren kvantitativnom PCR-om u stvarnom vremenu (qPCR)-MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) i AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Primarni neuroni su sastrugani u ledeno hladnom 1x PBS-u, peletirani, a zatim homogenizirani u 0,5% Triton X-100 / 0,5% natrijum deoksiholata/PBS puferu za lizu koji sadrži fosfatazu i inhibitor proteaze (Roche). Kvantifikacija proteina je izvršena korištenjem testa bicinhoninske kiseline (Thermo Fisher Scientific). Proteini su zatim odvojeni SDS-poliakrilamidnom gel elektroforezom, a zatim blotirani na poliviniliden fluoridnu membranu (GE Healthcare). Blokirajte nespecifična mjesta i inkubirajte s primarnim antitijelom (vidi Tabelu S1 za detalje) u 5% mlijeku u TBST-u (Tris-puferirani fiziološki rastvor sa Tween-om), koraci ispiranja i sekundarno antitijelo u TBST inkubaciji. Inkubirajte s primarnim antitijelom preko noći na +4°C. Nakon ispiranja, nanesite sekundarno antitijelo 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon toga, inkubacijom istog blota s anti-β-aktinskim antitijelom, potvrđeno je isto punjenje. Detekcija pretvaranjem u hemiluminiscenciju i pojačavanjem hemiluminiscencije (GE Healthcare).
Neuroni prethodno zasijani na pokrovna stakalca fiksirani su sa 4% paraformaldehida (PFA)/PBS u određenom vremenskom trenutku na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Pokrivna stakalca su prvo permeirana sa 0,1% Triton X-100/PBS tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim u blokirajućem puferu [3% goveđi serumski albumin (BSA)/PBS]. Drugog dana, pokrovna stakalca su isprana blokirajućim puferom i inkubirana sa odgovarajućim sekundarnim antitijelom konjugiranim sa fluoroforom tokom 2 sata na sobnoj temperaturi; na kraju, uzorci su temeljito isprani u PBS-u sa 4',6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI) kontrastno obojeni, a zatim fiksirani na mikroskopsko stakalce sa Aqua-Poly/Mount.
Miševi (muški i ženski) su anestezirani intraperitonealnom injekcijom ketamina (130 mg/kg) i ksilazina (10 mg/kg) te im je subkutano primijenjen analgetik karprofen (5 mg/kg). Nakon toga, smješteni su u stereotaktički instrument (Kopf) opremljen toplim jastučićem. Lobanja je otkrivena i zubnom bušilicom je istanjen dio cerebelarne kore koji odgovara mis kosti (od lambda: rep 1,8, lateralno 1, što odgovara lobuli IV i V). Zakrivljenom iglom šprice pažljivo je napravljena mala rupa u lubanji kako bi se izbjeglo oštećenje vaskularnog sistema ispod. Zatim je tanka staklena kapilara polako umetnuta u mikro-rupu (od -1,3 do -1 na ventralnoj strani dura mater), a 200 do 300 nl AAV-a je ubrizgano u mikro-injektor (Narishige) ručnim špricama (Narishige) nekoliko puta pod niskim pritiskom tokom vremenskog perioda od 10 do 20 minuta. Nakon infuzije, kapilaru stavite još 10 minuta kako bi se virus potpuno proširio. Nakon što se kapilare povuku, koža se pažljivo zašije kako bi se smanjila upala rane i omogućio oporavak životinje. Životinje su tretirane analgeticima (kaspofen) nekoliko dana nakon operacije, tokom kojih je njihovo fizičko stanje pažljivo praćeno, a zatim su eutanazirane u navedenom vremenskom trenutku. Svi postupci su provedeni u skladu s evropskim, nacionalnim i institucionalnim smjernicama i odobreni su od strane LandesamtfürNatur of Umwelt end Verbraucherschutz, Sjeverna Rajna-Vestfalija, Njemačka.
Životinje su anestezirane ketaminom (100 mg/kg) i ksilazinom (10 mg/kg), a srce je prvo perfuzirano sa 0,1 M PBS-om, a zatim sa 4% PFA u PBS-u. Tkivo je disecirano i fiksirano u 4% PFA/PBS-u preko noći na 4°C. Vibrirajući nož (Leica Microsystems GmbH, Beč, Austrija) korišten je za pripremu sagitalnih presjeka (debljine 50 μm) iz fiksiranog mozga u PBS-u. Osim ako nije drugačije navedeno, bojenje slobodno plutajućih presjeka izvršeno je kao što je gore opisano (13) na sobnoj temperaturi i miješanju. Ukratko, prvo su dobijeni presjeci permeabilizirani sa 0,5% Triton X-100/PBS tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi; za neke epitope (Pcx i Shmt2), zagrijavanjem presjeka 25 minuta u tris-EDTA puferu na 80°C (pH 9) umjesto ovog koraka. Zatim su presjeci inkubirani s primarnim antitijelom (vidi Tabelu S1) u puferu za blokiranje (3% BSA/PBS) na 4°C preko noći uz miješanje. Sljedećeg dana, presjeci su isprani puferom za blokiranje i inkubirani s odgovarajućim sekundarnim antitijelom konjugiranim s fluoroforom tokom 2 sata na sobnoj temperaturi; na kraju, presjeci su temeljito isprani u PBS-u, obojeni s DAPI-jem, a zatim fiksirani s AquaPolymountom na mikroskopskom pločici.
Za snimanje uzorka korišten je laserski skenirajući konfokalni mikroskop (TCS SP8-X ili TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) opremljen bijelim laserom i ultraljubičastim laserom od 405 dioda. Pobuđivanjem fluorofora i prikupljanjem signala pomoću hibridnog detektora (HyDs), korišten je LAS-X softver za prikupljanje složenih slika u skladu s Nyquistovim uzorkovanjem u sekvencijalnom režimu: za nekvantitativne panele, to su visoko dinamički signali (na primjer, u somatskim ćelijama i dendritima) (mtYFP). Koristite HyD za detekciju broja PN-ova u BrightR režimu. Primjenjuje se sinhronizacija od 0,3 do 6 ns za smanjenje pozadine.
Snimanje sortiranih ćelija u realnom vremenu. Nakon sortiranja u Neurobasal-A medijumu koji sadrži 1% dodatka B27 i 0,5 mM GlutaMax-a, ćelije su odmah zasijane na staklene pločice obložene poli-l-lizinom (μ-Slide8 Well, Ibidi, kataloški broj 80826), a zatim su držane na 37°C i 5% CO2 tokom 1 sata kako bi se ćelije slegle. Snimanje u realnom vremenu je izvršeno na Leica SP8 laserskom skenirajućem konfokalnom mikroskopu opremljenom bijelim laserom, HyD, uljnim objektivom 63×[1,4 numerička apertura (NA)] i grijaćim postoljem.
Miš je brzo anesteziran ugljičnim dioksidom i dekapitiran, mozak je brzo uklonjen iz lobanje i izrezan na sagitalne presjeke debljine 200 μm (za eksperiment označavanja 13C) ili 275 μm debljine (za eksperimente s dva fotona) ispunjene sljedećim materijalima: Sladoled (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Njemačka) je napunjen sljedećim supstancama: 125 mM ledeno hladna, ugljikom zasićena (95% O2 i 5% CO2) vještačka cerebrospinalna tekućina (ACSF) s niskim sadržajem Ca2 + NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijum fosfatni pufer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukoza, 0,5 mM CaCl2 i 3,5 mM MgCl2 (osmotski pritisak od 310 do 330 mmol). Dobijene kriške mozga prebacite u komoru za prethodnu inkubaciju koja sadrži viši Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijum fosfatni pufer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoza, 1,0 mM CaCl2 i 2,0 mM MgCl2) medij) pH 7,4 i 310 do 320 mmol).
Tokom procesa snimanja, kriške su premještene u namjensku prostoriju za snimanje, a eksperiment je proveden pod kontinuiranom ACSF perfuzijom na konstantnoj temperaturi od 32° do 33°C. Za snimanje kriški korišten je multifotonski laserski skenirajući mikroskop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) opremljen objektivom Leica 25x (NA 0.95, voda) i Ti:Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent). FLIM modul (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Promjene u citoplazmatskom redoks stanju PN-ova mjerene su dvofotonskim FLIM-om u sagitalnim presjecima mozga, gdje je Grx1-roGFP2 biosenzor ciljao PN-ove. U PN sloju, polje akvizicije je odabrano oko 50 do 80 μm ispod površine presjeka kako bi se osiguralo da postoji održiv PN (tj. nedostatak zrnaste strukture ili neuronskih morfoloških promjena duž dendrita) i dvostruko pozitivni roGFP2 senzor i AAV koji kodiraju shRNA PCx ili njenu kontrolnu sekvencu (svaki koeksprimira mCherry). Prikupljaju se slike jednog slaganja pomoću 2x digitalnog zuma [talasna dužina pobuđivanja: 890 nm; 512 nm 512 piksela]. Detekcija: interni HyD, fluorescein izotiocijanat (FITC) filter grupa] i usrednjavanje slike unutar 2 do 3 minute se koristi kako bi se osiguralo da se prikupi dovoljno fotona (ukupno 1000 fotona) za fitovanje krivulje. Osjetljivost Grx1-roGFP2 sonde i verifikacija FLIM uslova izvršene su praćenjem vrijednosti životnog vijeka roGFP2 pri dodavanju egzogenih 10 mM H2O2 u perfuzijski ACSF (radi maksimiziranja oksidacije, što rezultira povećanjem životnog vijeka), a zatim dodavanjem 2 mM ditiotreitola (minimiziranje stepena redukcije, što rezultira smanjenjem životnog vijeka) (Slika S8, D do G). Koristite FLIMfit 5.1.1 softver za analizu dobijenih rezultata, prilagodite pojedinačnu eksponencijalnu krivulju raspada cijele slike izmjerenom IRF-u (funkcija odziva instrumenta), a χ2 je približno 1. Da bi se izračunao životni vijek jednog PN-a, maska ​​oko tijela nerva je ručno nacrtana, a prosječni životni vijek u svakoj maski je korišten za kvantifikaciju.
Analiza mitohondrijalnog potencijala. Nakon što je akutni dio inkubiran sa 100 nM TMRM direktno dodanim u perfuzirani ACSF tokom 30 minuta, promjene mitohondrijalnog potencijala PN-ova mjerene su dvofotonskim mikroskopom. TMRM snimanje je izvedeno pobuđivanjem sonde na 920 nm i korištenjem internog HyD-a (tetrametilrodamin izotiocijanat: 585/40 nm) za prikupljanje signala; korištenjem iste talasne dužine pobuđivanja, ali korištenjem drugog internog HyD-a (FITC: 525/50) za snimanje mtYFP-a. Koristite ImageJ-ov dodatak Image Calculator za procjenu mitohondrijalnog potencijala na nivou pojedinačne ćelije. Ukratko, jednačina dodatka: signal = min (mtYFP, TMRM) se koristi za identifikaciju mitohondrijalne regije koja prikazuje TMRM signal u Purkinje Somaliju na konfokalnoj slici odgovarajućeg kanala u jednom sloju. Zatim se površina piksela u rezultirajućoj maski kvantificira, a zatim normalizira na odgovarajućoj pragovoj jednoslojnoj slici mtYFP kanala kako bi se dobila mitohondrijska frakcija koja prikazuje mitohondrijski potencijal.
Slika je dekonvoluirana pomoću Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) softvera. Za skenirane slike pločica, montaža jedne pločice je napravljena korištenjem algoritma za automatsko spajanje koji pruža LAS-X softver. Nakon kalibracije slike, koristite ImageJ i Adobe Photoshop za daljnju obradu slike i ravnomjerno podešavanje svjetline i kontrasta. Za grafičku pripremu koristite Adobe Illustrator.
Analiza fokusa mtDNK. Broj lezija mtDNK kvantificiran je na cerebelarnim presjecima obilježenim antitijelima protiv DNK pomoću konfokalnog mikroskopa. Svako ciljno područje kreirano je za tijelo ćelije i jezgro svake ćelije, a odgovarajuće područje izračunato je pomoću dodatka Multi Measure (softver ImageJ). Oduzmite površinu jezgra od površine tijela ćelije da biste dobili citoplazmatsku površinu. Konačno, dodatak Analyze Particles (softver ImageJ) korišten je za automatsku kvantifikaciju citoplazmatskih DNK tačaka koje ukazuju na mtDNK na pragu slike, a dobijeni rezultati su normalizirani na PN prosjek CTRL miševa. Rezultati su izraženi kao prosječan broj nukleozida po ćeliji.
Analiza ekspresije proteina. Koristite ImageJ-ov dodatak Image Calculator za procjenu ekspresije proteina u PN na nivou pojedinačne ćelije. Ukratko, na jednoslojnoj konfokalnoj slici odgovarajućeg kanala, putem jednačine: signal = min (mtYFP, antitijelo), identificira se mitohondrijska regija koja pokazuje imunoreaktivnost na određeno antitijelo u Purkini. Zatim se kvantificira površina piksela u rezultirajućoj maski, a zatim normalizira na odgovarajućoj pragovoj jednoslojnoj slici mtYFP kanala kako bi se dobila mitohondrijska frakcija prikazanog proteina.
Analiza gustoće Purkinjeovih ćelija. Za procjenu gustoće Purkinjeovih ćelija korišten je dodatak Cell Counter programa ImageJ dijeljenjem broja prebrojanih Purkinjeovih ćelija s dužinom cerebelarnog prstena koji zauzimaju prebrojane ćelije.
Priprema i prikupljanje uzoraka. Mozgovi kontrolne grupe i Mfn2cKO miševa fiksirani su u 2% PFA/2,5% glutaraldehida u 0,1 M fosfatnom puferu (PB), a zatim su pripremljeni koronalni rezovi korištenjem cilijata (Leica Mikrosysteme GmbH, Beč, Austrija) (debljina 50 do 60 μm). Zatim su fiksirani u PB puferu u 1% tetraoksidu i 1,5% kalijum ferocijanidu na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Rezovi su tri puta isprani destilovanom vodom, a zatim obojeni 70% etanolom koji sadrži 1% uranil acetata tokom 20 minuta. Rezovi su zatim dehidrirani u graduiranom alkoholu i ugrađeni u epoksidnu smolu Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, kataloški broj 14040) između staklenih pločica obloženih silikonom, i konačno na 60°C polimerizirani u pećnici tokom 48 sati. Područje cerebelarne kore je odabrano i ultratanki rezovi debljine 50 nm su izrezani na Leica Ultracut mikroskopu (Leica Mikrosysteme GmbH, Beč, Austrija) i uhvaćeni na bakrenoj mreži s prorezima dimenzija 2×1 mm obloženoj polistirenskim filmom. Rezovi su obojeni rastvorom 4% uranil acetata u H2O tokom 10 minuta, isprani sa H2O nekoliko puta, zatim sa Reynolds olovnim citratom u H2O tokom 10 minuta, a potom isprani sa H2O nekoliko puta. Mikrografije su snimljene transmisionim elektronskim mikroskopom Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) korištenjem digitalne kamere TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, SAD). Njemačka).
Kod miševa zaraženih AAV-om, mozak je odvojen i prerezan na sagitalni presjek debljine 1 mm, a mali mozak je pregledan fluorescentnim mikroskopom kako bi se identificirao prsten zaražen AAV-om (tj. onaj koji eksprimira mCherry). Korišteni su samo eksperimenti u kojima injekcija AAV-a rezultira vrlo visokom efikasnošću transdukcije sloja Purkinjeovih ćelija (tj. gotovo cijelog sloja) u najmanje dva uzastopna cerebelarna prstena. Petlja transducirana AAV-om je mikrodisekirana za noćnu postfiksaciju (4% PFA i 2,5% glutaraldehida u 0,1 M kokoatnom puferu) i dalje obrađena. Za ugradnju EPON-a, fiksirano tkivo je isprano sa 0,1 M natrijum kokoatnim puferom (Applichem) i inkubirano sa 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) u 0,1 M natrijum kokoatnom puferu (Applichem) 4 sata, a zatim isprano 2 sata. Ponovite 3 puta sa 0,1 M kokamidnim puferom. Nakon toga, uzlazni niz etanola korišten je za inkubaciju svakog rastvora etanola na 4°C tokom 15 minuta kako bi se tkivo dehidriralo. Tkivo je prebačeno u propilen oksid i inkubirano preko noći u EPON-u (Sigma-Aldrich) na 4°C. Tkivo je stavljeno u svježi EPON na sobnoj temperaturi na 2 sata, a zatim uronjeno u 62°C tokom 72 sata. Korištenjem ultramikrotoma (Leica Microsystems, UC6) i dijamantskog noža (Diatome, Biel, Švicarska) izrezani su ultratanki dijelovi od 70 nm, te obojeni sa 1,5% uranil acetatom tokom 15 minuta na 37°C, te obojeni rastvorom olovnog citrata 4 minute. Elektronske mikrografije su snimljene korištenjem JEM-2100 Plus transmisionog elektronskog mikroskopa (JEOL) opremljenog Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) i DigitalMicrograph softverom (Gatan). Za analizu, elektronske mikrografije su snimljene sa digitalnim zumom od 5000× ili 10.000×.
Morfološka analiza mitohondrija. Za sve analize, konture pojedinačnih mitohondrija su ručno ocrtane na digitalnim slikama korištenjem ImageJ softvera. Analizirani su različiti morfološki parametri. Gustina mitohondrija je izražena kao procenat dobijen dijeljenjem ukupne površine mitohondrija svake ćelije sa površinom citoplazme (površina citoplazme = površina ćelije - površina ćelijskog jezgra) × 100. Okruglost mitohondrija je izračunata formulom [4π∙(površina/perimetar 2)]. Analizirana je morfologija mitohondrija i podijeljena u dvije kategorije („tubularne“ i „mjehuraste“) prema njihovim glavnim oblicima.
Analiza broja i gustoće autofagosoma/lizosoma. Koristite ImageJ softver za ručno ocrtavanje kontura svakog autofagosoma/lizosoma na digitalnoj slici. Površina autofagosoma/lizosoma izražava se kao postotak izračunat dijeljenjem ukupne površine strukture autofagosoma/lizosoma svake ćelije s površinom citoplazme (površina citoplazme = površina ćelije - površina jezgra) × 100. Gustina autofagosoma/lizosoma izračunava se dijeljenjem ukupnog broja s brojem struktura autofagosoma/lizosoma po ćeliji (u smislu citoplazmatske površine) (citoplazmatska površina = površina ćelije - površina jezgra).
Označavanje za akutno seciranje i pripremu uzorka. Za eksperimente koji zahtijevaju označavanje glukozom, prebacite akutne presjeke mozga u komoru za prethodnu inkubaciju koja sadrži zasićeni ugljik (95% O2 i 5% CO2), ACSF s visokim sadržajem Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijum fosfatni pufer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukozu, 1,0 mM CaCl2 i 2,0 mM MgCl2, podešeno na pH 7,4 i 310 do 320 mOsm), u kojoj je glukoza 13C6- glukozna supstitucija (Eurisotop, kataloški broj CLM-1396). Za eksperimente koji zahtijevaju označavanje piruvatom, prenesite akutne presjeke mozga u viši Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijum fosfatni pufer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoza, 1,0 mM CaCl2 i dodajte 2,0 mM MgCl2, podesite pH na 7,4 i 310 do 320 mOsm) i dodajte 1 mM 1-[1-13C]piruvata (Eurisotop, kataloški broj CLM-1082). Inkubirajte presjeke 90 minuta na 37°C. Na kraju eksperimenta, presjeci su brzo isprani vodenim rastvorom (pH 7,4) koji sadrži 75 mM amonijum karbonata, a zatim homogenizovani u 40:40:20 (v:v:v) acetonitril (ACN):metanol:voda. Nakon što su sekcije inkubirane na ledu 30 minuta, uzorci su centrifugirani na 21.000 g tokom 10 minuta na 4°C, a bistri supernatant je osušen u SpeedVac koncentratoru. Dobiveni osušeni talog metabolita je pohranjen na -80°C do analize.
Analiza aminokiselina obilježenih sa 13C metodom tečne hromatografije i masene spektrometrije. Za analizu tečnom hromatografijom i masenom spektrometrijom (LC-MS), talog metabolita je resuspendovan u 75 μl vode LC-MS kvaliteta (Honeywell). Nakon centrifugiranja na 21.000 g tokom 5 minuta na 4°C, 20 μl pročišćenog supernatanta je korišteno za analizu fluksa aminokiselina, dok je ostatak ekstrakta odmah korišten za analizu aniona (vidi dolje). Analiza aminokiselina je provedena korištenjem prethodno opisanog protokola derivatizacije benzoil hlorida (55, 56). U prvom koraku, 10 μl 100 mM natrijum karbonata (Sigma-Aldrich) je dodano u 20 μl ekstrakta metabolita, a zatim je 10 μl 2% benzoil hlorida (Sigma-Aldrich) dodano u ACN LC kvaliteta. Uzorak je kratko vrtložen, a zatim centrifugiran na 21.000 g tokom 5 minuta na 20°C. Prebacite bistri supernatant u bočicu za autosampler od 2 ml sa konusnim staklenim uloškom (volumen 200 μl). Uzorci su analizirani korištenjem Acquity iClass LC sistema ultra visokih performansi (Waters) povezanog sa Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) preciznim masenim spektrometrom visoke rezolucije (Thermo Fisher Scientific). Za analizu, 2 μl derivatiziranog uzorka je ubrizgano u kolonu od silika gela visoke čvrstoće dimenzija 100×1,0 mm (Waters) koja sadrži čestice veličine 1,8 μm. Brzina protoka je 100 μl/min, a puferski sistem se sastoji od pufera A (10 mM amonijum formata i 0,15% mravlja kiselina u vodi) i pufera B (ACN). Gradijent je sljedeći: 0%B u 0 minuta; 0%B. 0 do 15% B u 0 do 0,1 minuta; 15 do 17% B u 0,1 do 0,5 minuta; B od 17 do 55% u periodu od 0,5 do 14 minuta; B od 55 do 70% u periodu od 14 do 14,5 minuta; od 14,5 do 70 do 100% B u periodu od 18 minuta; 100% B u periodu od 18 do 19 minuta; 100 do 0% B u periodu od 19 do 19,1 minuta; 0% B u periodu od 19,1 do 28 minuta (55, 56). QE-HF maseni spektrometar radi u režimu pozitivne jonizacije sa rasponom mase m/z (odnos mase/naboja) od 50 do 750. Primijenjena rezolucija je 60.000, a dobijena ciljna jonska koncentracija kontrole pojačanja (AGC) je 3×106, a maksimalno vrijeme jonske koncentracije je 100 milisekundi. Izvor zagrijane elektrosprej ionizacije (ESI) radi na naponu raspršivanja od 3,5 kV, temperaturi kapilare od 250 °C, protoku zraka kroz omotač od 60 AU (proizvoljne jedinice) i pomoćnom protoku zraka od 20 AU. 250 °C. Sočivo S je postavljeno na 60 AU.
Analiza organskih kiselina obilježenih sa 13C metodom anionske hromatografije-MS. Preostali talog metabolita (55 μl) analiziran je korištenjem Dionex sistema ionske hromatografije (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) povezanog sa QE-HF masenim spektrometrom (Thermo Fisher Scientific). Ukratko, 5 μl ekstrakta metabolita ubrizgano je u Dionex IonPac AS11-HC kolonu opremljenu HPLC-om (2 mm × 250 mm, veličina čestica 4 μm, Thermo Fisher Scientific) u režimu parcijalne petlje sa omjerom punjenja od 1. ) Dionex IonPac AG11-HC zaštitna kolona (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Temperatura kolone se održava na 30°C, a autosampler je postavljen na 6°C. Koristite uložak kalijum hidroksida koji je isporučen sa deionizovanom vodom za generisanje gradijenta kalijum hidroksida kroz generator eluenta. Odvajanje metabolita pri brzini protoka od 380μl/min, primjenom sljedećeg gradijenta: 0 do 3 minute, 10 mM KOH; 3 do 12 minuta, 10 do 50 mM KOH; 12 do 19 minuta, 50 do 100 mM KOH; 19 do 21 minuta, 100 mM KOH; 21 do 21,5 minuta, 100 do 10 mM KOH. Kolona je ponovo uravnotežena pod 10 mM KOH tokom 8,5 minuta.
Eluirani metaboliti se nakon kolone kombiniraju s dodatnim protokom izopropanola od 150 μl/min, a zatim usmjeravaju u maseni spektrometar visoke rezolucije koji radi u modu negativne ionizacije. MS prati raspon mase od m/z 50 do 750 s rezolucijom od 60.000. AGC je postavljen na 1×106, a maksimalno vrijeme iona održava se na 100 ms. Zagrijani ESI izvor radio je na naponu raspršivanja od 3,5 kV. Ostala podešavanja izvora iona su sljedeća: temperatura kapilare 275°C; protok plina omotača, 60 AU; protok pomoćnog plina, 20 AU na 300°C i podešavanje S sočiva na 60 AU.
Analiza podataka metabolita obilježenih sa 13C. Za analizu podataka omjera izotopa upotrijebite TraceFinder softver (verzija 4.2, Thermo Fisher Scientific). Identitet svakog spoja provjeren je pouzdanim referentnim spojem i nezavisno analiziran. Kako bi se izvršila analiza obogaćivanja izotopa, površina ekstrahiranog ionskog hromatograma (XIC) svakog izotopa 13C (Mn) ekstrahirana je iz [M + H] +, gdje je n broj ugljika ciljnog spoja, koji se koristi za analizu aminokiselina ili [MH] + koji se koristi za analizu aniona. Tačnost mase XIC-a je manja od pet dijelova na milion, a tačnost RT je 0,05 minuta. Analiza obogaćivanja se vrši izračunavanjem omjera svakog detektovanog izotopa prema zbiru svih izotopa odgovarajućeg spoja. Ovi omjeri su dati kao procentualne vrijednosti za svaki izotop, a rezultati su izraženi kao molarni postotak obogaćivanja (MPE), kao što je prethodno opisano (42).
Zamrznuti neuronski talog je homogeniziran u ledeno hladnom 80% metanolu (v/v), vrtložen i inkubiran na -20°C tokom 30 minuta. Uzorak je ponovo vrtložen i miješan na +4°C tokom 30 minuta. Uzorak je centrifugiran na 21.000 g tokom 5 minuta na 4°C, a zatim je dobiveni supernatant sakupljen i osušen pomoću SpeedVac koncentratora na 25°C za naknadnu analizu. Kao što je gore opisano, LC-MS analiza je provedena na aminokiselinama sortiranih ćelija. Korištenjem TraceFinder-a (verzija 4.2, Thermo Fisher Scientific), analiza podataka je provedena korištenjem monoizotopske mase svakog spoja. Kvantilna normalizacija podataka o metabolitima je izvršena korištenjem softverskog paketa preprocessCore (57).
Priprema kriški. Miš je brzo anesteziran ugljičnim dioksidom i dekapitiran, mozak je brzo uklonjen iz lobanje, a vibrirajući nož napunjen ledom (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Njemačka) je korišten za rezanje na sagitalne presjeke od 300 do 375 μm. Hladna gasifikacija ugljikom (95% O2 i 5% CO2) Nizak Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijum fosfatni pufer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoza, 1,0 mM CaCl2 i 6,0 mM MgCl2 Podešavanje pH na 7,4 i 310 do 330 mOsm). Dobijene moždane kriške prebacite u komoru koja sadrži viši Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijum fosfatni pufer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoza, 4,0 mM CaCl2 i 3,5 mM MgCl2) pH 7,4 i 310 do 320 mOsm. Čuvajte kriške 20 do 30 minuta kako bi se mogle restaurirati prije snimanja.
Snimanje. Za sva snimanja korišten je mikroskopski stolić opremljen fiksnom komorom za snimanje i objektivom za imerziju u vodu sa 20x uvećanjem (Scientifica). Pretpostavljene Purkinjeove ćelije identificirane su (i) veličinom tijela, (ii) anatomskom lokacijom malog mozga i (iii) ekspresijom fluorescentnog mtYFP reporterskog gena. Patch pipeta s otporom vrha od 5 do 11 megaoma izvlači se pomoću borosilikatne staklene kapilare (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Njemačka) i horizontalne pipete Instruments (P-1000, Sutter), Novato, Kalifornija. Sva snimanja su izvršena pomoću ELC-03XS npi patch clamp pojačala (npi electronic GmbH, Tam, Njemačka), kojim je upravljao softver Signal (verzija 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Eksperiment je sniman pri frekvenciji uzorkovanja od 12,5 kHz. Signal se filtrira pomoću dva kratkopropusna Bessel filtera s graničnim frekvencijama od 1,3 i 10 kHz, respektivno. Kapacitet membrane i pipete kompenzira se kompenzacijskim kolom pomoću pojačala. Svi eksperimenti su provedeni pod kontrolom Orca-Flash 4.0 kamere (Hamamatsu, Gerden, Njemačka), kojom je upravljao Hokawo softver (verzija 2.8, Hamamatsu, Gerden, Njemačka).
Rutinska konfiguracija i analiza cijelih ćelija. Neposredno prije snimanja, napunite pipetu unutrašnjim rastvorom koji sadrži sljedeće supstance: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kalijum glukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM gvanozin trifosfat (GTP) (Na) i 10,0 mM kreatinin fosfat, pH je podešen na 7,25, a osmotski pritisak je bio 290 mOsm (saharoza). Odmah nakon primjene sile od 0 pA za probijanje membrane, izmjeren je membranski potencijal mirovanja. Ulazni otpor se mjeri primjenom hiperpolarizovanih struja od -40, -30, -20 i -10 pA. Izmjerite magnitudu naponskog odziva i koristite Ohmov zakon za izračunavanje ulaznog otpora. Spontana aktivnost je zabilježena u naponskim stezaljkama tokom 5 minuta, a sPSC je identificiran i izmjeren u Igor Pro programu (verzija 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, SAD) korištenjem poluautomatskog skripta za prepoznavanje. IV krivulja i struja u stacionarnom stanju mjere se stezanjem baterije na različitim potencijalima (počevši od -110 mV) i povećanjem napona u koracima od 5 mV. Proizvodnja AP-a (naponskog potencijala) testirana je primjenom depolarizirajuće struje. Ćelija se steže na -70 mV dok se primjenjuje impuls depolarizirajuće struje. Podesite veličinu koraka svake jedinice za snimanje zasebno (10 do 60 pA). Izračunajte maksimalnu AP frekvenciju ručnim brojanjem impulsnih šiljaka koji uzrokuju najvišu AP frekvenciju. AP prag se analizira korištenjem druge derivacije depolarizacijskog impulsa koji prvi pokreće jedan ili više AP-ova.
Konfiguracija i analiza perforiranog flastera. Izvršite snimanje perforiranog flastera koristeći standardne protokole. Koristite pipetu bez ATP-a i GTP-a koja ne sadrži sljedeće sastojke: 128 mM glukonata K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA i 2 mM MgCl2, i podesite pH na 7,2 (koristeći KOH). ATP i GTP su izostavljeni iz intracelularnog rastvora kako bi se spriječila nekontrolirana propusnost ćelijske membrane. Pipeta s flasterom se puni unutrašnjim rastvorom koji sadrži amfotericin (približno 200 do 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) kako bi se dobio zapis perforiranog flastera. Amfotericin je rastvoren u dimetil sulfoksidu (konačna koncentracija: 0,1 do 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Koncentracija korištenog DMSO nije imala značajan uticaj na proučavane neurone. Tokom procesa probijanja, otpor kanala (Ra) je kontinuirano praćen, a eksperiment je započet nakon što se amplituda Ra i AP stabilizovala (20-40 minuta). Spontana aktivnost se mjeri u naponskim i/ili strujnim stezaljkama tokom 2 do 5 minuta. Analiza podataka je izvršena korištenjem Igor Pro (verzija 7.05.2, WaveMetrics, SAD), Excel (verzija 2010, Microsoft Corporation, Redmond, SAD) i GraphPad Prism (verzija 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Za identifikaciju spontanih AP-ova koristi se IgorPro-ov NeuroMatic v3.0c dodatak. Automatski identifikuju AP-ove koristeći dati prag, koji se podešava pojedinačno za svaki zapis. Koristeći interval šiljaka, odredite frekvenciju šiljaka sa maksimalnom trenutnom frekvencijom šiljaka i prosječnom frekvencijom šiljaka.
Izolacija PN. Prilagođavanjem prethodno objavljenom protokolu, PN su pročišćene iz mišjeg malog mozga u određenoj fazi (58). Ukratko, mali mozak je diseciran i usitnjen u ledeno hladnom mediju za disocijaciju [bez HBSS Ca2+ i Mg2+, dopunjen sa 20 mM glukoze, penicilina (50 U/ml) i streptomicina (0,05 mg/ml)], a zatim je medij razgrađen u papainu [HBSS, dopunjen sa 1-cistein·HCl (1 mg/ml), papainom (16 U/ml) i deoksiribonukleazom I (DNase I; 0,1 mg/ml)]. Tretirajte 30 minuta na 30°C. Prvo operite tkiva u HBSS mediju koji sadrži sluz jaja (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) i DNase (0,1 mg/ml) na sobnoj temperaturi kako biste spriječili enzimsku probavu, a zatim u HBSS mediju koji sadrži 20 mM glukoze. Laganim usitnjavanjem u HBSS-u, penicilinu (50 U/ml), streptomicinu (0,05 mg/ml) i DNase (0,1 mg/ml) oslobađaju se pojedinačne ćelije. Dobivena suspenzija ćelija je filtrirana kroz cjedilo za ćelije od 70 μm, zatim su ćelije peletirane centrifugiranjem (1110 rpm, 5 minuta, 4°C) i resuspendirane u mediju za sortiranje [HBSS, dopunjen sa 20 mM glukoze, 20% fetalnog goveđeg seruma, penicilina (50 U/ml) i streptomicina (0,05 mg/ml)]; procijenite održivost ćelija pomoću propidijum jodida i podesite gustinu ćelija na 1×106 do 2×106 ćelija/ml. Prije protočne citometrije, suspenzija je filtrirana kroz sito za ćelije od 50 μm.
Protočni citometar. Sortiranje ćelija je izvršeno na 4°C korištenjem FACSAria III uređaja (BD Biosciences) i FACSDiva softvera (BD Biosciences, verzija 8.0.1). Suspenzija ćelija je sortirana korištenjem mlaznice od 100 μm pod pritiskom od 20 psi brzinom od ~2800 događaja/sek. Budući da tradicionalni kriteriji za gating (veličina ćelija, bimodalna diskriminacija i karakteristike raspršenja) ne mogu osigurati ispravnu izolaciju PN od drugih tipova ćelija, strategija gatinga je postavljena na osnovu direktnog poređenja intenziteta YFP i autofluorescencije kod mitoYFP+ ​​​​i kontrolnih mitoYFP − miševa. YFP se pobuđuje ozračivanjem uzorka laserskom linijom od 488 nm, a signal se detektuje korištenjem propusnog filtera od 530/30 nm. Kod mitoYFP+ ​​​​miševa, relativna snaga reporterskog gena Rosa26-mitoYFP se također koristi za razlikovanje fragmenata neuronskog tijela i aksona. 7-AAD se pobuđuje žutim laserom od 561 nm i detektuje propusnim filterom od 675/20 nm kako bi se isključile mrtve ćelije. Kako bi se istovremeno odvojili astrociti, suspenzija ćelija je obojena ACSA-2-APC-om, zatim je uzorak ozračen laserskom linijom od 640 nm, a za detekciju signala korišten je propusni filter od 660/20 nm.
Sakupljene ćelije su peletirane centrifugiranjem (1110 rpm, 5 minuta, 4°C) i pohranjene na -80°C do upotrebe. Mfn2cKO miševi i njihovi mladunci iz legla su klasificirani istog dana kako bi se minimizirala varijabilnost procedure. FACS prezentacija i analiza podataka su izvršene korištenjem FlowJo softvera (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, SAD).
Kao što je gore spomenuto (59), PCR u realnom vremenu se koristi za izolaciju DNK iz sortiranih neurona za naknadnu kvantifikaciju mtDNK. Linearnost i prag osjetljivosti su inicijalno testirani izvođenjem qPCR-a na različitom broju ćelija. Ukratko, sakupljeno je 300 PN u puferu za lizu koji se sastoji od 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 i proteinaze K (200 ng/ml) i inkubirano na 55°C 120 minuta. Ćelije su dalje inkubirane na 95°C tokom 10 minuta kako bi se osigurala potpuna inaktivacija proteinaze K. Korištenjem TaqMan sonde (Thermo Fisher) specifične za mt-Nd1, mtDNK je izmjerena semikvantitativnom PCR u 7900HT Real-Time PCR sistemu (Thermo Fisher Scientific). Science, kataloški broj Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, kataloški broj AIVI3E8) i 18S (Thermo Fisher Scientific, kataloški broj Hs99999901_s1) geni.
Priprema uzorka proteoma. Zagrijavanjem rastvora na 95°C tokom 10 minuta i sonikacijom, u puferu za lizu [6 M gvanidin hlorid, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfin hidrohlorid, 10 mM hloroacetamid i 100 mM tris-Lyse smrznutih neuronskih peleta u HCl]. Na Bioruptoru (Diagenode) tokom 10 minuta (30 sekundi pulsa / 30 sekundi pauze). Uzorak je razrijeđen 1:10 u 20 mM tris-HCl (pH 8,0), pomiješan sa 300 ng tripsin zlata (Promega) i inkubiran preko noći na 37°C kako bi se postigla potpuna digestija. Drugog dana, uzorak je centrifugiran na 20.000 g tokom 20 minuta. Supernatant je razrijeđen sa 0,1% mravljom kiselinom, a rastvor je desaliniziran pomoću StageTips-a. Uzorak je osušen u SpeedVac instrumentu (Eppendorf koncentrator plus 5305) na 45°C, a zatim je peptid suspendovan u 0,1% mravljoj kiselini. Sve uzorke je istovremeno pripremila ista osoba. Kako bi se analizirali uzorci astrocita, 4 μg desaliniziranih peptida je obilježeno tandemskom masenom oznakom (TMT10plex, kataloški broj 90110, Thermo Fisher Scientific) sa omjerom peptida i TMT reagensa od 1:20. Za TMT označavanje, 0,8 mg TMT reagensa je resuspendovano u 70 μl bezvodnog ACN-a, a osušeni peptid je rekonstituisan u 9 μl 0,1 M TEAB-a (trietilamonijum bikarbonata), kojem je dodano 7 μl TMT reagensa u ACN-u. Koncentracija je bila 43,75%. Nakon 60 minuta inkubacije, reakcija je ugašena sa 2 μl 5% hidroksilamina. Označeni peptidi su sakupljeni, osušeni, resuspendirani u 200 μl 0,1% mravlje kiseline (FA), podijeljeni na dva dijela, a zatim desalinizirani korištenjem StageTips-a domaće izrade. Korištenjem UltiMate 3000 tečnog hromatografa ultra visokih performansi (UltiMate 3000 tečni hromatograf ultra visokih performansi), jedna od dvije polovine je frakcionirana na 1 mm x 150 mm Acquity hromatografskoj koloni napunjenoj sa 130Å1,7 μm C18 čestica (Waters, kataloški broj SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Peptide je potrebno odvojiti brzinom protoka od 30 μl/min, odvojiti od 1% do 50% pufera B tokom 85 minuta sa postepenim gradijentom od 96 minuta, od 50% do 95% pufera B tokom 3 minute, zatim 8 minuta za 95% pufera B; Pufer A je 5% ACN i 10 mM amonijum bikarbonata (ABC), a pufer B je 80% ACN i 10 mM ABC. Frakcije sakupljajte svake 3 minute i kombinujte ih u dvije grupe (1 + 17, 2 + 18, itd.) i osušite ih u vakuumskoj centrifugi.
LC-MS/MS analiza. Za masenu spektrometriju, peptidi (broj r119.aq) su odvojeni na analitičkoj koloni PicoFrit od 25 cm, unutrašnjeg promjera 75 μm (novo objektivno sočivo, broj dijela PF7508250) opremljenoj sa 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medijem (Dr. Maisch, mat), koristite EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Njemačka). Kolona je održavana na 50°C. Puferi A i B su 0,1% mravlja kiselina u vodi i 0,1% mravlja kiselina u 80% ACN, respektivno. Peptidi su odvojeni od 6% do 31% pufera B tokom 65 minuta i od 31% do 50% pufera B tokom 5 minuta sa gradijentom od 200 nl/min. Eluirani peptidi su analizirani na masenom spektrometru Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Mjerenje m/z prekursora peptida vrši se s rezolucijom od 120.000 u rasponu od 350 do 1500 m/z. Korištenjem 27% normalizirane energije sudara, najjači prekursor sa stanjem naboja od 2 do 6 odabran je za cijepanje disocijacijom C zamkom visoke energije (HCD). Vrijeme ciklusa postavljeno je na 1 s. Vrijednost m/z peptidnog fragmenta izmjerena je u ionskoj zamci korištenjem najmanje AGC mete od 5×104 i maksimalnog vremena ubrizgavanja od 86 ms. Nakon fragmentacije, prekursor je stavljen na listu dinamičkog isključenja na 45 s. TMT-obilježeni peptidi su odvojeni na 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap koloni (Thermo Fisher Scientific, kataloški broj 164942), a migracijski spektri su analizirani na Orbitrap Lumos Tribrid masenom spektrometru (Thermo Fisher Scientific) opremljenom opremom za asimetrične valne ione visokog polja (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) koja radi na dva kompenzacijska napona od -50 i -70 V. MS3 odabran na osnovu prekursora sinhronizacije koristi se za mjerenje signala TMT iona. Razdvajanje peptida provedeno je na EASY-nLC 1200, korištenjem 90% linearne gradijentne elucije, s koncentracijom pufera od 6% do 31%; pufer A je bio 0,1% FA, a pufer B je bio 0,1% FA i 80% ACN. Analitička kolona radi na 50°C. Koristite FreeStyle (verzija 1.6, Thermo Fisher Scientific) za dijeljenje originalne datoteke prema FAIMS kompenzacijskom naponu.
Identifikacija i kvantifikacija proteina. Korištenjem integriranog Andromeda pretraživača, originalni podaci su analizirani korištenjem MaxQuant verzije 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Pored sekvenci Cre rekombinaze i YFP dobijenih iz Aequorea victoria, spektri peptidnih fragmenata su pretraženi za kanonsku sekvencu i izoformnu sekvencu mišjeg referentnog proteoma (Proteome ID UP000000589, preuzet sa UniProt-a u maju 2017.). Oksidacija metionina i N-terminalna acetilacija proteina postavljene su kao varijabilne modifikacije; metilacija cistein karbamoila postavljena je kao fiksne modifikacije. Parametri probave su postavljeni na "specifičnost" i "tripsin/P". Minimalni broj peptida i razor peptida korištenih za identifikaciju proteina je 1; minimalni broj jedinstvenih peptida je 0. Pod uslovima podudaranja peptidne mape, stopa identifikacije proteina bila je 0,01. Opcija "Drugi peptid" je omogućena. Koristite opciju "podudaranje između prolaza" za prenos uspješnih identifikacija između različitih originalnih datoteka. Koristite LFQ minimalni omjer brojanja 1 za kvantifikaciju bez označavanja (LFQ) (60). Intenzitet LFQ-a se filtrira za najmanje dvije validne vrijednosti u najmanje jednoj genotipskoj grupi u svakoj vremenskoj tački i ekstrapolira se iz normalne distribucije širine od 0,3 i pomiče se prema dolje za 1,8. Koristite Perseus računarsku platformu (https://maxquant.net/perseus/) i R (https://r-project.org/) za analizu LFQ rezultata. Dvosmjerni umjereni t-test iz softverskog paketa limma korišten je za analizu diferencijalne ekspresije (61). Eksplorativna analiza podataka provedena je korištenjem ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally i pheatmap. Proteomski podaci zasnovani na TMT-u analizirani su korištenjem MaxQuant verzije 1.6.10.43. Pretražite sirove proteomske podatke iz UniProt-ove baze podataka o ljudskoj proteomici, koja je preuzeta u septembru 2018. Analiza uključuje faktor korekcije čistoće izotopa koji je dostavio proizvođač. Koristite limma u R-u za analizu diferencijalnih izraza. Originalni podaci, rezultati pretraživanja baze podataka i tijek rada i rezultati analize podataka pohranjeni su u savezu ProteomeXchange putem partnerskog repozitorija PRIDE s identifikatorom skupa podataka PXD019690.
Funkcionalne anotacije obogaćuju analizu. Alat Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) korišten je za određivanje bogatstva termina funkcionalnih anotacija skupa podataka nakon 8 sedmica (Slika 1). Ukratko, kvantitativna lista proteina dobijena analizom podataka LC-MS/MS (tandem masena spektrometrija) koristi se sa sljedećim kriterijima filtera: Mus musculus je odabran kao vrsta i pozadina, a kategorija prikazuje da se P vrijednost prilagođena Benjaminijem za obogaćivanje 0,05 ili niže smatra značajnom. Za ovaj grafikon prikazano je pet najvećih suvišnih kategorija u svakom klasteru na osnovu prilagođene P vrijednosti. Korištenjem višestrukog t-testa, korištenjem dvostepenog linearnog programa pojačanja Benjaminija, Kriegera i Yekutielija (Q = 5%), analiza ekspresije proteina u vremenskom periodu provedena je na važnim kandidatima identificiranim u svakoj kategoriji, a svaki red se analizira zasebno. Nema potrebe za usvajanjem konzistentne standardne devijacije (SD).
Kako bismo uporedili rezultate ove studije sa objavljenim bazama podataka i generirali Vennov dijagram na Slici 1, kombinovali smo kvantitativnu listu proteina sa MitoCarta 2.0 anotacijama (24). Za generiranje dijagrama koristili smo online alat Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
Za detaljne informacije o statističkim procedurama korištenim za proteomsku analizu, pogledajte odgovarajući odjeljak Materijali i metode. Za sve ostale eksperimente, detaljne informacije mogu se pronaći u odgovarajućoj legendi. Osim ako nije drugačije navedeno, svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM, a sve statističke analize su provedene korištenjem softvera GraphPad Prism 8.1.2.
Za dodatne materijale za ovaj članak, pogledajte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod uslovima Creative Commons licence Attribution-Non-Commercial, koja dozvoljava korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, sve dok konačna upotreba nije u komercijalne svrhe i pretpostavka je da je originalno djelo ispravno. Referenca.
Napomena: Molimo vas da navedete svoju email adresu samo kako bi osoba koju preporučite stranici znala da želite da vidi email i da se ne radi o neželjenoj pošti. Nećemo prikupljati email adrese.
Ovo pitanje se koristi za provjeru da li ste posjetilac i sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomska analiza disfunkcionalnih neurona otkrila je da se metabolički programi aktiviraju kako bi se suprotstavili neurodegeneraciji.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomska analiza disfunkcionalnih neurona otkrila je da se metabolički programi aktiviraju kako bi se suprotstavili neurodegeneraciji.
©2020 Američko udruženje za unapređenje nauke. sva prava pridržana. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.