Članak je dio istraživačke teme „Napredne tehnologije bioremedijacije i procesi recikliranja sintetičkih organskih spojeva (SOC)“. Pogledajte svih 14 članaka
Policiklički aromatični ugljikovodici (PAH) niske molekularne težine, poput naftalena i supstituiranih naftalena (metilnaftalen, naftojeva kiselina, 1-naftil-N-metilkarbamat, itd.), široko se koriste u raznim industrijama i genotoksični su, mutageni i/ili kancerogeni za organizme. Ovi sintetički organski spojevi (SOC) ili ksenobiotici smatraju se prioritetnim zagađivačima i predstavljaju ozbiljnu prijetnju globalnom okolišu i javnom zdravlju. Intenzitet ljudskih aktivnosti (npr. gasifikacija uglja, rafiniranje nafte, emisije vozila i poljoprivredna primjena) određuje koncentraciju, sudbinu i transport ovih sveprisutnih i perzistentnih spojeva. Pored fizičkih i hemijskih metoda tretmana/uklanjanja, zelene i ekološki prihvatljive tehnologije poput bioremedijacije, koje koriste mikroorganizme sposobne da potpuno razgrade POC-ove ili ih pretvore u netoksične nusproizvode, pojavile su se kao sigurna, isplativa i obećavajuća alternativa. Različite bakterijske vrste koje pripadaju koljenu Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia i Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus i Paenibacillus) i Actinobacteria (Rhodococcus i Arthrobacter) u mikrobioti tla pokazale su sposobnost razgradnje različitih organskih spojeva. Metaboličke studije, genomika i metagenomska analiza pomažu nam da razumijemo kataboličku složenost i raznolikost prisutnu u ovim jednostavnim oblicima života, što se dalje može primijeniti za efikasnu biodegradaciju. Dugoročno postojanje PAH-ova rezultiralo je pojavom novih fenotipova razgradnje putem horizontalnog prijenosa gena korištenjem genetskih elemenata kao što su plazmidi, transpozoni, bakteriofagi, genomska ostrva i integrativni konjugativni elementi. Sistemska biologija i genetski inženjering specifičnih izolata ili modelnih zajednica (konzorcija) mogu omogućiti sveobuhvatnu, brzu i efikasnu bioremedijaciju ovih PAH-ova putem sinergističkih efekata. U ovom pregledu fokusiramo se na različite metaboličke puteve i raznolikost, genetski sastav i raznolikost, te ćelijske odgovore/adaptacije bakterija koje razgrađuju naftalen i supstituirani naftalen. Ovo će pružiti ekološke informacije za primjenu na terenu i optimizaciju sojeva za efikasnu bioremedijaciju.
Brzi razvoj industrija (petrohemija, poljoprivreda, farmaceutski proizvodi, tekstilne boje, kozmetika itd.) doprinio je globalnom ekonomskom prosperitetu i poboljšanju životnog standarda. Ovaj eksponencijalni razvoj rezultirao je proizvodnjom velikog broja sintetičkih organskih spojeva (SOC), koji se koriste za proizvodnju različitih proizvoda. Ovi strani spojevi ili SOC uključuju policikličke aromatične ugljikovodike (PAH), pesticide, herbicide, plastifikatore, boje, farmaceutske proizvode, organofosfate, usporivače gorenja, isparljiva organska otapala itd. Oni se emituju u atmosferu, vodene i kopnene ekosisteme gdje imaju višedimenzionalne utjecaje, uzrokujući štetne učinke na različite bioforme kroz promjenu fizičko-hemijskih svojstava i strukture zajednice (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Mnogi aromatični zagađivači imaju snažan i destruktivan utjecaj na mnoge netaknute ekosisteme/vruće tačke biodiverziteta (npr. koraljni grebeni, arktički/antarktički ledeni pokrovi, visokoplaninska jezera, dubokomorski sedimenti itd.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Nedavne geomikrobiološke studije pokazale su da taloženje sintetičkih organskih materija (npr. aromatičnih zagađivača) i njihovih derivata na površinama vještačkih struktura (izgrađenog okruženja) (npr. mjesta kulturne baštine i spomenici od granita, kamena, drveta i metala) ubrzava njihovu degradaciju (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Ljudske aktivnosti mogu intenzivirati i pogoršati biološku degradaciju spomenika i zgrada putem zagađenja zraka i klimatskih promjena (Liu et al. 2020). Ovi organski zagađivači reaguju sa vodenom parom u atmosferi i talože se na strukturi, uzrokujući fizičku i hemijsku degradaciju materijala. Biodegradacija je široko prepoznata kao neželjene promjene u izgledu i svojstvima materijala uzrokovane živim organizmima koje utiču na njihovo očuvanje (Pochon i Jaton, 1967). Daljnje mikrobiološko djelovanje (metabolizam) ovih spojeva može smanjiti strukturni integritet, efikasnost očuvanja i kulturnu vrijednost (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). S druge strane, u nekim slučajevima, utvrđeno je da je mikrobiološka adaptacija i odgovor na ove strukture koristan jer one formiraju biofilmove i druge zaštitne kore koje smanjuju stopu propadanja/raspadanja (Martino, 2016). Stoga, razvoj efikasnih dugoročnih održivih strategija očuvanja kamenih, metalnih i drvenih spomenika zahtijeva temeljito razumijevanje ključnih procesa uključenih u ovaj proces. U poređenju s prirodnim procesima (geološki procesi, šumski požari, vulkanske erupcije, biljne i bakterijske reakcije), ljudske aktivnosti rezultiraju oslobađanjem velikih količina policikličkih aromatičnih ugljikovodika (PAH) i drugog organskog ugljika (OC) u ekosisteme. Mnogi PAH-ovi koji se koriste u poljoprivredi (insekticidi i pesticidi poput DDT-a, atrazina, karbarila, pentaklorofenola itd.), industriji (sirova nafta, naftni mulj/otpad, plastika dobivena iz nafte, PCB-i, plastifikatori, deterdženti, dezinficijensi, fumiganti, mirisi i konzervansi), proizvodima za ličnu njegu (kreme za sunčanje, dezinficijensi, repelenti za insekte i policiklički mošusi) i municiji (eksplozivi poput 2,4,6-TNT-a) su potencijalni ksenobiotici koji mogu utjecati na zdravlje planete (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna i Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Ova lista se može proširiti i na spojeve dobivene iz nafte (loživa ulja, maziva, asfalteni), bioplastiku visoke molekularne težine i ionske tekućine (Amde et al., 2015). Tabela 1 navodi različite aromatične zagađivače i njihovu primjenu u različitim industrijama. Posljednjih godina, antropogene emisije isparljivih organskih spojeva, kao i ugljikovog dioksida i drugih stakleničkih plinova, počele su se povećavati (Dvorak et al., 2017). Međutim, antropogeni utjecaji značajno premašuju prirodne. Osim toga, otkrili smo da određeni broj organskih organskih spojeva (SOC) opstaje u mnogim okolišnim okruženjima i identificirani su kao novi zagađivači sa štetnim utjecajima na biome (Slika 1). Agencije za zaštitu okoliša, poput Agencije za zaštitu okoliša Sjedinjenih Američkih Država (USEPA), uvrstile su mnoge od ovih zagađivača na svoju listu prioriteta zbog njihovih citotoksičnih, genotoksičnih, mutagenih i kancerogenih svojstava. Stoga su potrebni strogi propisi o odlaganju i učinkovite strategije za tretman/uklanjanje otpada iz kontaminiranih ekosistema. Različite fizičke i hemijske metode tretmana, kao što su piroliza, oksidativni termički tretman, aeracija zraka, odlaganje na deponije, spaljivanje itd., neučinkovite su i skupe te stvaraju korozivne, toksične i teško obrađive nusproizvode. S rastućom globalnom ekološkom sviješću, mikroorganizmi sposobni za razgradnju ovih zagađivača i njihovih derivata (kao što su halogenirani, nitro, alkil i/ili metil) privlače sve veću pažnju (Fennell et al., 2004; Haritash i Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Upotreba ovih autohtonih kandidatskih mikroorganizama, samostalno ili u mješovitim kulturama (kolonijama) za uklanjanje aromatičnih zagađivača, ima prednosti u smislu ekološke sigurnosti, troškova, efikasnosti, efektivnosti i održivosti. Istraživači također istražuju integraciju mikrobnih procesa s elektrohemijskim redoks metodama, naime bioelektrohemijskim sistemima (BES), kao obećavajuću tehnologiju za tretman/uklanjanje zagađivača (Huang et al., 2011). BES tehnologija privlači sve veću pažnju zbog svoje visoke efikasnosti, niske cijene, sigurnosti za okoliš, rada na sobnoj temperaturi, biokompatibilnih materijala i sposobnosti oporavka vrijednih nusproizvoda (npr. električne energije, goriva i hemikalija) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Pojava visokopropusnog sekvenciranja genoma i omics alata/metoda pružila je obilje novih informacija o genetičkoj regulaciji, proteomici i fluksomici reakcija različitih mikroorganizama razgradnje. Kombiniranje ovih alata sa sistemskom biologijom dodatno je unaprijedilo naše razumijevanje selekcije i finog podešavanja ciljnih kataboličkih puteva u mikroorganizmima (tj. metabolički dizajn) kako bi se postigla efikasna i efektivna biodegradacija. Da bismo dizajnirali efikasne strategije bioremedijacije korištenjem odgovarajućih kandidatskih mikroorganizama, moramo razumjeti biohemijski potencijal, metaboličku raznolikost, genetski sastav i ekologiju (autoekologija/sinekologija) mikroorganizama.
Sl. 1. Izvori i putevi niskomolekularnih PAH-ova kroz različite okolišne sredine i različite faktore koji utiču na biotu. Isprekidane linije predstavljaju interakcije između elemenata ekosistema.
U ovom pregledu pokušali smo sažeti podatke o razgradnji jednostavnih PAH-ova poput naftalena i supstituiranih naftalena pomoću različitih bakterijskih izolata, pokrivajući metaboličke puteve i raznolikost, enzime uključene u razgradnju, sastav/sadržaj i raznolikost gena, ćelijske odgovore i različite aspekte bioremedijacije. Razumijevanje biohemijskih i molekularnih nivoa pomoći će u identifikaciji odgovarajućih sojeva domaćina i njihovom daljem genetskom inženjeringu za efikasnu bioremedijaciju takvih prioritetnih zagađivača. Ovo će pomoći u razvoju strategija za uspostavljanje bakterijskih konzorcija specifičnih za lokaciju za efikasnu bioremedijaciju.
Prisustvo velikog broja toksičnih i opasnih aromatičnih spojeva (koji zadovoljavaju Huckelovo pravilo 4n + 2π elektrona, n = 1, 2, 3, ...) predstavlja ozbiljnu prijetnju različitim medijima okoliša kao što su zrak, tlo, sedimenti te površinske i podzemne vode (Puglisi et al., 2007). Ovi spojevi imaju pojedinačne benzenske prstenove (monociklički) ili višestruke benzenske prstenove (policiklički) raspoređene u linearnom, ugaonom ili klaster obliku i pokazuju stabilnost (stabilnost/nestabilnost) u okolišu zbog visoke negativne rezonantne energije i inertnosti (inertnosti), što se može objasniti njihovom hidrofobnošću i reduciranim stanjem. Kada se aromatični prsten dalje zamijeni metil (-CH3), karboksil (-COOH), hidroksil (-OH) ili sulfonatnim (-HSO3) grupama, on postaje stabilniji, ima jači afinitet za makromolekule i bioakumulativan je u biološkim sistemima (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Neki policiklički aromatični ugljikovodici niske molekularne težine (LMWAH), poput naftalena i njegovih derivata [metilnaftalen, naftojeva kiselina, naftalensulfonat i 1-naftil N-metilkarbamat (karbaril)], uvršteni su na listu prioritetnih organskih zagađivača od strane Agencije za zaštitu okoliša SAD-a kao genotoksični, mutageni i/ili kancerogeni (Cerniglia, 1984). Ispuštanje ove klase NM-PAH u okoliš može rezultirati bioakumulacijom ovih spojeva na svim nivoima lanca ishrane, što utiče na zdravlje ekosistema (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Izvori i putevi PAH-ova do biote su prvenstveno migracija i interakcije između različitih komponenti ekosistema kao što su tlo, podzemne vode, površinske vode, usjevi i atmosfera (Arey i Atkinson, 2003). Slika 1 prikazuje interakcije i distribuciju različitih PAH-ova niske molekularne težine u ekosistemima i njihove puteve do biote/izloženosti ljudi. PAH-ovi se talože na površinama kao rezultat zagađenja zraka i migracijom (driftom) emisija vozila, industrijskih ispušnih plinova (gasifikacija uglja, sagorijevanje i proizvodnja koksa) i njihovim taloženjem. Industrijske aktivnosti poput proizvodnje sintetičkih tekstila, boja i lakova; konzervacija drveta; prerada gume; aktivnosti proizvodnje cementa; proizvodnja pesticida; i poljoprivredna primjena glavni su izvori PAH-ova u kopnenim i vodenim sistemima (Bamforth i Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Studije su pokazale da su tla u prigradskim i urbanim područjima, u blizini autoputeva i u velikim gradovima podložnija policikličkim aromatskim ugljikovodicima (PAH) zbog emisija iz elektrana, grijanja stambenih objekata, opterećenja zračnog i cestovnog prometa te građevinskih aktivnosti (Suman et al., 2016). (2008) je pokazalo da su PAH-ovi u tlu u blizini cesta u New Orleansu, Louisiana, SAD, iznosili čak 7189 μg/kg, dok su na otvorenom prostoru iznosili samo 2404 μg/kg. Slično tome, zabilježeni su nivoi PAH-ova i do 300 μg/kg u područjima u blizini lokacija za gasifikaciju uglja u nekoliko američkih gradova (Kanaly i Harayama, 2000; Bamforth i Singleton, 2005). Prijavljeno je da tla iz raznih indijskih gradova kao što su Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni i Venkataraman, 2000) i Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) sadrže visoke koncentracije PAH-ova. Aromatični spojevi se lakše adsorbiraju na čestice tla, organsku tvar i minerale gline, te tako postaju glavni ponori ugljika u ekosistemima (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Glavni izvori PAH-ova u vodenim ekosistemima su padavine (vlažne/suhe padavine i vodena para), gradsko otjecanje, ispuštanje otpadnih voda, obnavljanje podzemnih voda itd. (Srogi, 2007). Procjenjuje se da oko 80% PAH-ova u morskim ekosistemima potiče od padavina, sedimentacije i ispuštanja otpada (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Veće koncentracije PAH-ova u površinskim vodama ili procjednim vodama s odlagališta čvrstog otpada na kraju prodiru u podzemne vode, što predstavlja veliku prijetnju javnom zdravlju, budući da više od 70% stanovništva u Južnoj i Jugoistočnoj Aziji pije podzemne vode (Duttagupta et al., 2019). Nedavna studija Duttagupte i sar. (2020) o analizama rijeka (32) i podzemnih voda (235) iz Zapadnog Bengala, Indija, otkrila je da se procjenjuje da 53% urbanih stanovnika i 44% ruralnih stanovnika (ukupno 20 miliona stanovnika) može biti izloženo naftalenu (4,9–10,6 μg/L) i njegovim derivatima. Različiti obrasci korištenja zemljišta i povećana ekstrakcija podzemnih voda smatraju se glavnim faktorima koji kontroliraju vertikalni transport (advekciju) PAH-ova niske molekularne težine u podzemlju. Utvrđeno je da su poljoprivredno otjecanje, ispuštanje komunalnih i industrijskih otpadnih voda te ispuštanje čvrstog otpada/smeća pogođeni PAH-ovima u riječnim slivovima i podzemnim sedimentima. Atmosferske padavine dodatno pogoršavaju zagađenje PAH-ovima. Visoke koncentracije PAH-ova i njihovih alkil derivata (ukupno 51) zabilježene su u rijekama/slivovima širom svijeta, kao što su rijeke Fraser, Louan, Denso, Missouri, Anacostia, Ebro i Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). U sedimentima sliva rijeke Ganges, naftalen i fenantren su utvrđeni kao najznačajniji (detektovani u 70% uzoraka) (Duttagupta et al., 2019). Štaviše, studije su pokazale da hlorisanje vode za piće može dovesti do stvaranja toksičnijih oksigeniranih i hlorisanih PAH-ova (Manoli i Samara, 1999). PAH-ovi se akumuliraju u žitaricama, voću i povrću kao rezultat apsorpcije u biljke iz kontaminiranog tla, podzemnih voda i oborina (Fismes et al., 2002). Mnogi vodeni organizmi poput ribe, dagnji, školjki i škampa kontaminirani su PAH-ovima konzumiranjem kontaminirane hrane i morske vode, kao i putem tkiva i kože (Mackay i Fraser, 2000). Metode kuhanja/obrade poput roštiljanja, pečenja, dimljenja, prženja, sušenja, pečenja u pećnici i kuhanja na drveni ugalj također mogu dovesti do značajnih količina PAH-ova u hrani. To uvelike ovisi o izboru materijala za dimljenje, sadržaju fenolnih/aromatičnih ugljikovodika, postupku kuhanja, vrsti grijača, sadržaju vlage, opskrbi kisikom i temperaturi sagorijevanja (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Policiklički aromatični ugljikovodici (PAH) također su otkriveni u mlijeku u različitim koncentracijama (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Akumulacija ovih PAH-ova u hrani također ovisi o fizičko-hemijskim svojstvima hrane, dok su njihovi toksični efekti povezani s fiziološkim funkcijama, metaboličkom aktivnošću, apsorpcijom, distribucijom i distribucijom u tijelu (Mechini et al., 2011).
Toksičnost i štetni efekti policikličkih aromatskih ugljikovodika (PAH) poznati su već dugo vremena (Cherniglia, 1984). Policiklički aromatski ugljikovodici niske molekularne težine (LMW-PAH) (dva do tri prstena) mogu se kovalentno vezati za različite makromolekule poput DNK, RNK i proteina te su kancerogeni (Santarelli et al., 2008). Zbog svoje hidrofobne prirode, odvojeni su lipidnim membranama. Kod ljudi, citokrom P450 monooksigenaze oksidiraju PAH u epokside, od kojih su neki vrlo reaktivni (npr. baediol epoksid) i mogu dovesti do transformacije normalnih ćelija u maligne (Marston et al., 2001). Osim toga, produkti transformacije PAH-ova poput kinona, fenola, epoksida, diola itd. toksičniji su od matičnih spojeva. Neki PAH-ovi i njihovi metabolički međuprodukti mogu utjecati na hormone i različite enzime u metabolizmu, čime negativno utječu na rast, centralni nervni sistem, reproduktivni i imunološki sistem (Swetha i Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Prijavljeno je da kratkotrajna izloženost PAH-ovima niske molekularne težine uzrokuje oštećenu funkciju pluća i trombozu kod astmatičara te da povećava rizik od raka kože, pluća, mjehura i gastrointestinalnog trakta (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Studije na životinjama također su pokazale da izloženost PAH-ovima može imati negativne učinke na reproduktivnu funkciju i razvoj te može uzrokovati kataraktu, oštećenje bubrega i jetre te žuticu. Pokazalo se da različiti produkti biotransformacije PAH-ova, poput diola, epoksida, kinona i slobodnih radikala (kationa), formiraju DNK adukte. Pokazalo se da stabilni adukti mijenjaju mehanizam replikacije DNK, dok nestabilni adukti mogu depurinirati DNK (uglavnom do adenina, a ponekad i do gvanina); oba mogu generirati greške koje dovode do mutacija (Schweigert et al. 2001). Osim toga, kinoni (benzo-/pan-) mogu generirati reaktivne vrste kisika (ROS), uzrokujući fatalna oštećenja DNK i drugih makromolekula, čime utječu na funkciju/vijabilnost tkiva (Ewa i Danuta 2017). Prijavljeno je da kronična izloženost niskim koncentracijama pirena, bifenila i naftalena uzrokuje rak kod eksperimentalnih životinja (Diggs et al. 2012). Zbog njihove smrtonosne toksičnosti, čišćenje/uklanjanje ovih PAH-ova sa pogođenih/kontaminiranih mjesta je prioritet.
Različite fizičke i hemijske metode korištene su za uklanjanje PAH-ova sa kontaminiranih mjesta/okoliša. Procesi poput spaljivanja, dekloriranja, UV oksidacije, fiksacije i ekstrakcije rastvaračima imaju mnoge nedostatke, uključujući stvaranje toksičnih nusprodukata, složenost procesa, sigurnosne i regulatorne probleme, nisku efikasnost i visoke troškove. Međutim, mikrobna biodegradacija (nazvana bioremedijacija) je obećavajući alternativni pristup koji uključuje upotrebu mikroorganizama u obliku čistih kultura ili kolonija. U poređenju sa fizičkim i hemijskim metodama, ovaj proces je ekološki prihvatljiv, neinvazivan, isplativ i održiv. Bioremedijacija se može provoditi na pogođenom mjestu (in situ) ili na posebno pripremljenom mjestu (ex situ) i stoga se smatra održivijom metodom remedijacije od tradicionalnih fizičkih i hemijskih metoda (Juhasz i Naidu, 2000; Andreoni i Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Razumijevanje mikrobnih metaboličkih koraka uključenih u razgradnju aromatičnih zagađivača ima ogromne naučne i ekonomske implikacije za ekološku i okolišnu održivost. Procjenjuje se da se 2,1×10^18 grama ugljika (C) skladišti u sedimentima i organskim spojevima (tj. nafti, prirodnom plinu i uglju, tj. fosilnim gorivima) širom svijeta, što značajno doprinosi globalnom ciklusu ugljika. Međutim, brza industrijalizacija, ekstrakcija fosilnih goriva i ljudske aktivnosti iscrpljuju ove litosferske rezervoare ugljika, oslobađajući procijenjenih 5,5×10^15 g organskog ugljika (kao zagađivača) u atmosferu godišnje (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Većina ovog organskog ugljika ulazi u kopnene i morske ekosisteme putem sedimentacije, transporta i otjecanja. Osim toga, novi sintetički zagađivači dobiveni iz fosilnih goriva, poput plastike, plastifikatora i stabilizatora plastike (ftalati i njihovi izomeri), ozbiljno zagađuju morske, tla i vodene ekosisteme i njihov biota, čime se pogoršavaju globalne klimatske rizike. Različite vrste mikroplastike, nanoplastike, plastičnih fragmenata i njihovih toksičnih monomernih proizvoda izvedenih iz polietilen tereftalata (PET) akumulirale su se u Tihom okeanu između Sjeverne Amerike i Jugoistočne Azije, formirajući "Veliku pacifičku krpu smeća", šteteći morskom životu (Newell et al., 2020). Naučne studije su dokazale da nije moguće ukloniti takve zagađivače/otpad bilo kojim fizičkim ili hemijskim metodama. U tom kontekstu, najkorisniji mikroorganizmi su oni koji su sposobni oksidativno metabolizirati zagađivače u ugljični dioksid, hemijsku energiju i druge netoksične nusproizvode koji na kraju ulaze u druge procese kruženja hranjivih tvari (H, O, N, S, P, Fe, itd.). Stoga je razumijevanje mikrobne ekofiziologije mineralizacije aromatičnih zagađivača i njene kontrole okoliša ključno za procjenu mikrobnog ciklusa ugljika, neto budžeta ugljika i budućih klimatskih rizika. S obzirom na hitnu potrebu za uklanjanjem takvih spojeva iz okoliša, pojavile su se različite eko-industrije usmjerene na čiste tehnologije. Alternativno, valorizacija industrijskog otpada/otpadnih hemikalija akumuliranih u ekosistemima (tj. pristup "od otpada do bogatstva") smatra se jednim od stubova kružne ekonomije i ciljeva održivog razvoja (Close et al., 2012). Stoga je razumijevanje metaboličkih, enzimskih i genetskih aspekata ovih potencijalnih kandidata za razgradnju od najveće važnosti za efikasno uklanjanje i bioremedijaciju takvih aromatičnih zagađivača.
Među mnogim aromatičnim zagađivačima, posebnu pažnju posvećujemo PAH-ovima niske molekularne težine kao što su naftalen i supstituirani naftaleni. Ovi spojevi su glavne komponente goriva dobivenih iz nafte, tekstilnih boja, potrošačkih proizvoda, pesticida (sredstava protiv moljaca i repelenta za insekte), plastifikatora i tanina te su stoga široko rasprostranjeni u mnogim ekosistemima (Preuss et al., 2003). Nedavni izvještaji ističu akumulaciju koncentracija naftalena u sedimentima vodonosnika, podzemnim vodama i podzemnim tlima, vadoznim zonama i riječnim koritima, što ukazuje na njegovu bioakumulaciju u okolišu (Duttagupta et al., 2019, 2020). Tabela 2 sažima fizičko-hemijska svojstva, primjenu i zdravstvene učinke naftalena i njegovih derivata. U usporedbi s drugim PAH-ovima visoke molekularne težine, naftalen i njegovi derivati ​​su manje hidrofobni, više topljivi u vodi i široko rasprostranjeni u ekosistemima, pa se često koriste kao modelni supstrati za proučavanje metabolizma, genetike i metaboličke raznolikosti PAH-ova. Veliki broj mikroorganizama je sposoban metabolizirati naftalen i njegove derivate, a dostupne su sveobuhvatne informacije o njihovim metaboličkim putevima, enzimima i regulatornim karakteristikama (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Osim toga, naftalen i njegovi derivati ​​su označeni kao prototipni spojevi za procjenu zagađenja okoliša zbog njihove velike zastupljenosti i bioraspoloživosti. Agencija za zaštitu okoliša SAD-a procjenjuje da su prosječni nivoi naftalena 5,19 μg po kubnom metru iz dima cigareta, prvenstveno iz nepotpunog sagorijevanja, i 7,8 do 46 μg iz sporednog dima, dok je izloženost kreozotu i naftalenu 100 do 10.000 puta veća (Preuss et al. 2003). Posebno je utvrđeno da naftalen ima respiratornu toksičnost i karcinogenost specifičnu za vrstu, regiju i spol. Na osnovu studija na životinjama, Međunarodna agencija za istraživanje raka (IARC) klasifikovala je naftalen kao "mogući ljudski kancerogen" (Grupa 2B)1. Izloženost supstituiranim naftalenima, prvenstveno inhalacijom ili parenteralnom (oralnom) primjenom, uzrokuje oštećenje plućnog tkiva i povećava učestalost tumora pluća kod pacova i miševa (Nacionalni toksikološki program 2). Akutni efekti uključuju mučninu, povraćanje, bol u trbuhu, proljev, glavobolju, konfuziju, obilno znojenje, groznicu, tahikardiju itd. S druge strane, zabilježeno je da je insekticid širokog spektra na bazi karbamata karbaril (1-naftil N-metilkarbamat) toksičan za vodene beskičmenjake, vodozemce, medonosne pčele i ljude, a pokazalo se da inhibira acetilkolinesterazu uzrokujući paralizu (Smulders et al., 2003; Bulen i Distel, 2011). Stoga je razumijevanje mehanizama mikrobne razgradnje, genetske regulacije, enzimskih i ćelijskih reakcija ključno za razvoj strategija bioremedijacije u kontaminiranim okruženjima.
Tabela 2. Detaljne informacije o fizičko-hemijskim svojstvima, upotrebi, metodama identifikacije i povezanim bolestima naftalena i njegovih derivata.
U zagađenim nišama, hidrofobni i lipofilni aromatični zagađivači mogu uzrokovati različite ćelijske efekte na okolišni mikrobiom (zajednicu), kao što su promjene u fluidnosti membrane, propusnosti membrane, oticanje lipidnog dvosloja, poremećaj prijenosa energije (lanac transporta elektrona/pokretačka sila protona) i aktivnost proteina povezanih s membranom (Sikkema et al., 1995). Osim toga, neki topljivi međuprodukti poput katehola i kinona generiraju reaktivne vrste kisika (ROS) i formiraju adukte s DNK i proteinima (Penning et al., 1999). Dakle, obilje takvih spojeva u ekosistemima vrši selektivni pritisak na mikrobne zajednice da postanu efikasni degradatori na različitim fiziološkim nivoima, uključujući unos/transport, unutarćelijsku transformaciju, asimilaciju/iskorištavanje i kompartmentalizaciju.
Pretraga Ribosomske baze podataka Projekta II (RDP-II) otkrila je da je ukupno 926 bakterijskih vrsta izolirano iz medija ili kultura obogaćenih naftalinom ili njegovim derivatima. Grupa Proteobacteria imala je najveći broj predstavnika (n = 755), a slijede Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) i neklasificirane bakterije (8) (Slika 2). Predstavnici γ-Proteobacteria (Pseudomonadales i Xanthomonadales) dominirali su svim gram-negativnim grupama s visokim sadržajem G+C (54%), dok su Clostridiales i Bacillales (30%) bili gram-pozitivne grupe s niskim sadržajem G+C. Za Pseudomonas (najveći broj, 338 vrsta) utvrđeno je da mogu razgraditi naftalen i njegove metilne derivate u različitim zagađenim ekosistemima (katran uglja, nafta, sirova nafta, mulj, izlijevanja nafte, otpadne vode, organski otpad i deponije), kao i u netaknutim ekosistemima (tlo, rijeke, sedimenti i podzemne vode) (Slika 2). Štaviše, studije obogaćivanja i metagenomska analiza nekih od ovih regija otkrile su da nekultivirane vrste Legionella i Clostridium mogu imati degradacijski kapacitet, što ukazuje na potrebu za kultivacijom ovih bakterija kako bi se proučili novi putevi i metabolička raznolikost.
Sl. 2. Taksonomska raznolikost i ekološka distribucija bakterijskih predstavnika u okruženjima kontaminiranim naftalenom i derivatima naftalena.
Među različitim mikroorganizmima koji razgrađuju aromatične ugljikovodike, većina je sposobna razgraditi naftalen kao jedini izvor ugljika i energije. Slijed događaja uključenih u metabolizam naftalena opisan je za Pseudomonas sp. (sojevi: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 i CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 i drugi sojevi (ND6 i AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis i Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Metabolizam pokreće višekomponentna dioksigenaza [naftalen dioksigenaza (NDO), dioksigenaza koja hidroksilira prsten] koja katalizira oksidaciju jednog od aromatičnih prstenova naftalena koristeći molekularni kisik kao drugi supstrat, pretvarajući naftalen u cis-naftalendiol (Slika 3). Cis-dihidrodiol se pretvara u 1,2-dihidroksinaftalen pomoću dehidrogenaze. Enzim koji cijepa prsten dioksigenaza, 1,2-dihidroksinaftalen dioksigenaza (12DHNDO), pretvara 1,2-dihidroksinaftalen u 2-hidroksihromen-2-karboksilnu kiselinu. Enzimska cis-trans izomerizacija proizvodi trans-o-hidroksibenzilidenpiruvat, koji se cijepa hidratazom aldolazom na salicilni aldehid i piruvat. Organska kiselina piruvat je bio prvi C3 spoj izveden iz naftalenskog ugljikovog skeleta i usmjeren u centralni ugljikov put. Osim toga, NAD+-ovisna salicilaldehid dehidrogenaza pretvara salicilaldehid u salicilnu kiselinu. Metabolizam u ovoj fazi naziva se "gornji put" degradacije naftalena. Ovaj put je vrlo čest kod većine bakterija koje degradiraju naftalen. Međutim, postoji nekoliko izuzetaka; na primjer, kod termofilnog Bacillus hamburgii 2, degradaciju naftalena pokreće naftalen 2,3-dioksigenaza dajući 2,3-dihidroksinaftalen (Annweiler et al., 2000).
Slika 3. Putevi razgradnje naftalena, metilnaftalena, naftojeve kiseline i karbarila. Zaokruženi brojevi predstavljaju enzime odgovorne za sekvencijalnu konverziju naftalena i njegovih derivata u naknadne produkte. 1 — naftalen dioksigenaza (NDO); 2, cis-dihidrodiol dehidrogenaza; 3, 1,2-dihidroksinaftalen dioksigenaza; 4, izomeraza 2-hidroksihromen-2-karboksilne kiseline; 5, trans-O-hidroksibenzilidenpiruvat hidrataza aldolaza; 6, salicilaldehid dehidrogenaza; 7, salicilat 1-hidroksilaza; 8, katehol 2,3-dioksigenaza (C23DO); 9, 2-hidroksimukonat semialdehid dehidrogenaza; 10, 2-oksopent-4-enoat hidrataza; 11, 4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolaza; 12, acetaldehid dehidrogenaza; 13, katehol-1,2-dioksigenaza (C12DO); 14, mukonat cikloizomeraza; 15, mukonolakton delta-izomeraza; 16, β-ketoadipatenolakton hidrolaza; 17, β-ketoadipat sukcinil-CoA transferaza; 18, β-ketoadipat-CoA tiolaza; 19, sukcinil-CoA: acetil-CoA sukciniltransferaza; 20, salicilat 5-hidroksilaza; 21 – gentizat 1,2-dioksigenaza (GDO); 22, maleilpiruvat izomeraza; 23, fumarilpiruvat hidrolaza; 24, metilnaftalen hidroksilaza (NDO); 25, hidroksimetilnaftalen dehidrogenaza; 26, naftaldehid dehidrogenaza; 27, 3-formilsalicilna kiselina oksidaza; 28, hidroksiizoftalat dekarboksilaza; 29, karbaril hidrolaza (CH); 30, 1-naftol-2-hidroksilaza.
U zavisnosti od organizma i njegovog genetskog sastava, rezultirajuća salicilna kiselina se dalje metabolizira ili putem kateholnog puta koristeći salicilat 1-hidroksilazu (S1H) ili putem gentizatnog puta koristeći salicilat 5-hidroksilazu (S5H) (Slika 3). Budući da je salicilna kiselina glavni međuprodukt u metabolizmu naftalena (gornji put), koraci od salicilne kiseline do TCA međuprodukta često se nazivaju donjim putem, a geni su organizirani u jedan operon. Uobičajeno je vidjeti da su geni u operonu gornjeg puta (nah) i operonu donjeg puta (sal) regulirani zajedničkim regulatornim faktorima; na primjer, NahR i salicilna kiselina djeluju kao induktori, omogućavajući oba operona da potpuno metaboliziraju naftalen (Phale et al., 2019, 2020).
Osim toga, katehol se ciklički cijepa na 2-hidroksimukonat semialdehid putem meta puta pomoću katehol 2,3-dioksigenaze (C23DO) (Yen et al., 1988) i dalje hidrolizira pomoću 2-hidroksimukonat semialdehid hidrolaze da bi se formirala 2-hidroksipent-2,4-dienska kiselina. 2-hidroksipent-2,4-dienoat se zatim pretvara u piruvat i acetaldehid pomoću hidrataze (2-oksopent-4-enoat hidrataza) i aldolaze (4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolaza), a zatim ulazi u centralni ugljični put (Slika 3). Alternativno, katehol se ciklički cijepa na cis,cis-mukonat putem orto puta pomoću katehol 1,2-oksigenaze (C12DO). Mukonat cikloizomeraza, mukonolakton izomeraza i β-ketoadipat-nolakton hidrolaza pretvaraju cis,cis-mukonat u 3-oksoadipat, koji ulazi u centralni ugljikov put putem sukcinil-CoA i acetil-CoA (Nozaki et al., 1968) (Slika 3).
U gentizatnom (2,5-dihidroksibenzoatnom) putu, aromatični prsten se cijepa pomoću gentizat 1,2-dioksigenaze (GDO) da bi se formirao maleilpiruvat. Ovaj produkt se može direktno hidrolizovati u piruvat i malat, ili se može izomerizirati da bi se formirao fumarilpiruvat, koji se zatim može hidrolizovati u piruvat i fumarat (Larkin i Day, 1986). Izbor alternativnog puta je uočen i kod gram-negativnih i kod gram-pozitivnih bakterija na biohemijskom i genetskom nivou (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Gram-negativne bakterije (Pseudomonas) preferiraju korištenje salicilne kiseline, koja je induktor metabolizma naftalena, dekarboksilirajući je u katehol pomoću salicilat 1-hidroksilaze (Gibson i Subramanian, 1984). S druge strane, kod gram-pozitivnih bakterija (Rhodococcus), salicilat 5-hidroksilaza pretvara salicilnu kiselinu u gentizinsku kiselinu, dok salicilna kiselina nema induktivni učinak na transkripciju naftalenskih gena (Grund et al., 1992) (Slika 3).
Prijavljeno je da vrste poput Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas i Mycobacterium mogu razgraditi monometilnaftalen ili dimetilnaftalen (Dean-Raymond i Bartha, 1975; Cane i Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Među njima, put razgradnje 1-metilnaftalena i 2-metilnaftalena kod Pseudomonas sp. CSV86 je jasno proučen na biohemijskom i enzimskom nivou (Mahajan et al., 1994). 1-Metilnaftalen se metabolizira putem dva puta. Prvo, aromatični prsten se hidroksilira (nesupstituirani prsten metilnaftalena) da bi se formirao cis-1,2-dihidroksi-1,2-dihidro-8-metilnaftalen, koji se dalje oksidira u metil salicilat i metilkatehol, a zatim ulazi u centralni ugljikov put nakon cijepanja prstena (Slika 3). Ovaj put se naziva "put izvora ugljika". U drugom "putu detoksikacije", metilna grupa se može hidroksilirati pomoću NDO da bi se formirao 1-hidroksimetilnaftalen, koji se dalje oksidira u 1-naftojevu kiselinu i izlučuje u medij za kulturu kao produkt bez potencijala. Studije su pokazale da soj CSV86 ne može rasti na 1- i 2-naftojevoj kiselini kao jedinom izvoru ugljika i energije, što potvrđuje njegov put detoksikacije (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). U 2-metilnaftalenu, metilna grupa se hidroksilira pomoću hidroksilaze da bi se formirao 2-hidroksimetilnaftalen. Osim toga, nesupstituirani prsten naftalenskog prstena podliježe hidroksilaciji prstena da bi se formirao dihidrodiol, koji se oksidira do 4-hidroksimetilkatehol u nizu enzimski kataliziranih reakcija i ulazi u centralni ugljikov put putem puta cijepanja meta-prstena. Slično tome, za S. paucimobilis 2322 je objavljeno da koristi NDO za hidroksilaciju 2-metilnaftalena, koji se dalje oksidira da bi se formirao metil salicilat i metilkatehol (Dutta et al., 1998).
Naftojeve kiseline (supstituirane/nesupstituirane) su nusproizvodi detoksikacije/biotransformacije koji nastaju tokom razgradnje metilnaftalena, fenantrena i antracena i oslobađaju se u iskorišteni medij za kulturu. Prijavljeno je da je izolat iz tla, Stenotrophomonas maltophilia CSV89, sposoban metabolizirati 1-naftojevu kiselinu kao izvor ugljika (Phale et al., 1995). Metabolizam počinje dihidroksilacijom aromatičnog prstena da bi se formirao 1,2-dihidroksi-8-karboksinaftalen. Dobiveni diol se oksidira u katehol putem 2-hidroksi-3-karboksibenzilidenpiruvata, 3-formilsalicilne kiseline, 2-hidroksiizoftalne kiseline i salicilne kiseline i ulazi u centralni put ugljika putem puta cijepanja meta-prstena (Slika 3).
Karbaril je pesticid naftil karbamata. Od Zelene revolucije u Indiji 1970-ih, upotreba hemijskih gnojiva i pesticida dovela je do povećanja emisija policikličkih aromatičnih ugljikovodika (PAH) iz poljoprivrednih disperzionih izvora (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Procjenjuje se da se 55% (85.722.000 hektara) ukupnog obradivog zemljišta u Indiji tretira hemijskim pesticidima. Tokom posljednjih pet godina (2015–2020), indijski poljoprivredni sektor je u prosjeku godišnje koristio 55.000 do 60.000 tona pesticida (Odjel za zadruge i dobrobit poljoprivrednika, Ministarstvo poljoprivrede, Vlada Indije, august 2020). U sjevernim i centralnim gangeskim ravnicama (države s najvećom populacijom i gustoćom naseljenosti), upotreba pesticida na usjevima je široko rasprostranjena, a insekticidi prevladavaju. Karbaril (1-naftil-N-metilkarbamat) je karbamatni insekticid širokog spektra djelovanja, umjereno do visoko toksičan, koji se koristi u indijskoj poljoprivredi u prosječnoj količini od 100-110 tona. Obično se prodaje pod trgovačkim nazivom Sevin i koristi se za suzbijanje insekata (lisnih uši, vatrenih mrava, buha, grinja, pauka i mnogih drugih vanjskih štetočina) koji utiču na razne usjeve (kukuruz, soju, pamuk, voće i povrće). Neki mikroorganizmi poput Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus i Arthrobacter također se mogu koristiti za suzbijanje drugih štetočina. Prijavljeno je da RC100 može razgraditi karbaril (Larkin i Day, 1986; Chapalamadugu i Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha i Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Put razgradnje karbarila opsežno je proučavan na biohemijskom, enzimskom i genetskom nivou u izolatima Pseudomonas sp. Sojevi C4, C5 i C6 iz tla (Swetha i Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Sl. 3). Metabolički put započinje hidrolizom esterske veze pomoću karbaril hidrolaze (CH) da bi se formirao 1-naftol, metilamin i ugljen-dioksid. 1-naftol se zatim pretvara u 1,2-dihidroksinaftalen pomoću 1-naftol hidroksilaze (1-NH), koji se dalje metabolizira putem centralnog ugljeničnog puta preko salicilata i gentizata. Prijavljeno je da neke bakterije koje razgrađuju karbaril metaboliziraju naftalen u salicilnu kiselinu putem cijepanja katehol orto prstena (Larkin i Day, 1986; Chapalamadugu i Chaudhry, 1991). Važno je napomenuti da bakterije koje razgrađuju naftalen prvenstveno metaboliziraju salicilnu kiselinu putem katehola, dok bakterije koje razgrađuju karbaril preferiraju metabolizirati salicilnu kiselinu putem gentizatnog puta.
Derivati ​​naftalensulfonske kiseline/disulfonske kiseline i naftilaminsulfonske kiseline mogu se koristiti kao međuprodukti u proizvodnji azo boja, sredstava za kvašenje, disperzanata itd. Iako ovi spojevi imaju nisku toksičnost za ljude, procjene citotoksičnosti su pokazale da su smrtonosni za ribe, dafnije i alge (Greim et al., 1994). Prijavljeno je da predstavnici roda Pseudomonas (sojevi A3, C22) pokreću metabolizam dvostrukom hidroksilacijom aromatičnog prstena koji sadrži sulfonsku kiselinsku grupu, formirajući dihidrodiol, koji se dalje pretvara u 1,2-dihidroksinaftalen spontanim cijepanjem sulfitne grupe (Brilon et al., 1981). Rezultirajući 1,2-dihidroksinaftalen se katabolizira klasičnim naftalenskim putem, tj. kateholnim ili gentizatnim putem (Slika 4). Pokazano je da aminonaftalensulfonska kiselina i hidroksinaftalensulfonska kiselina mogu biti potpuno razgrađene miješanim bakterijskim konzorcijima s komplementarnim kataboličkim putevima (Nortemann et al., 1986). Pokazano je da jedan član konzorcija desumporizira aminonaftalensulfonsku kiselinu ili hidroksinaftalensulfonsku kiselinu 1,2-dioksigenacijom, dok se aminosalicilat ili hidroksisalicilat oslobađa u medij za kulturu kao metabolit koji se potom apsorbira od strane drugih članova konzorcija. Naftalendisulfonska kiselina je relativno polarna, ali slabo biorazgradiva i stoga se može metabolizirati različitim putevima. Prva desumporizacija se događa tokom regioselektivne dihidroksilacije aromatičnog prstena i sulfonske kiselinske grupe; druga desumporizacija se događa tokom hidroksilacije 5-sulfosalicilne kiseline pomoću salicilne kiseline 5-hidroksilaze da bi se formirala gentizinska kiselina, koja ulazi u centralni ugljikov put (Brilon et al., 1981) (Slika 4). Enzimi odgovorni za razgradnju naftalena također su odgovorni za metabolizam naftalen sulfonata (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Slika 4. Metabolički putevi za razgradnju naftalen sulfonata. Brojevi unutar krugova predstavljaju enzime odgovorne za metabolizam naftil sulfonata, slične/identične enzimima opisanim na SLICI 3.
PAH-ovi niske molekularne težine (LMW-PAH) su reducibilni, hidrofobni i slabo rastvorljivi, te stoga nisu podložni prirodnoj razgradnji/degradaciji. Međutim, aerobni mikroorganizmi ih mogu oksidirati apsorpcijom molekularnog kisika (O2). Ovi enzimi uglavnom pripadaju klasi oksidoreduktaza i mogu izvoditi različite reakcije kao što su hidroksilacija aromatičnog prstena (mono- ili dihidroksilacija), dehidrogenacija i cijepanje aromatičnog prstena. Produkti dobijeni ovim reakcijama su u višem oksidacijskom stanju i lakše se metaboliziraju kroz centralni ugljikov put (Phale et al., 2020). Prijavljeno je da su enzimi u putu razgradnje inducibilni. Aktivnost ovih enzima je vrlo niska ili zanemariva kada se ćelije uzgajaju na jednostavnim izvorima ugljika kao što su glukoza ili organske kiseline. Tabela 3 sažima različite enzime (oksigenaze, hidrolaze, dehidrogenaze, oksidaze itd.) uključene u metabolizam naftalena i njegovih derivata.
Tabela 3. Biohemijske karakteristike enzima odgovornih za razgradnju naftalena i njegovih derivata.
Radioizotopske studije (18O2) su pokazale da je ugradnja molekularnog O2 u aromatične prstenove pomoću oksigenaza najvažniji korak u aktiviranju daljnje biodegradacije spoja (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Ugradnja jednog atoma kisika (O) iz molekularnog kisika (O2) u supstrat inicira se endogenim ili egzogenim monooksigenazama (također nazvanim hidroksilaze). Drugi atom kisika se reducira u vodu. Egzogene monooksigenaze redukuju flavin sa NADH ili NADPH, dok se kod endomonooksigenaza flavin reducira supstratom. Položaj hidroksilacije rezultira raznolikošću u formiranju produkta. Na primjer, salicilat 1-hidroksilaza hidroksilira salicilnu kiselinu na C1 položaju, formirajući katehol. S druge strane, višekomponentna salicilat 5-hidroksilaza (koja sadrži podjedinice reduktaze, feredoksina i oksigenaze) hidroksilira salicilnu kiselinu na C5 poziciji, formirajući gentizinsku kiselinu (Yamamoto et al., 1965).
Dioksigenaze ugrađuju dva atoma O2 u supstrat. U zavisnosti od formiranih produkata, dijele se na dioksigenaze koje hidroksiliraju prsten i dioksigenaze koje cijepaju prsten. Dioksigenaze koje hidroksiliraju prsten pretvaraju aromatične supstrate u cis-dihidrodiole (npr. naftalen) i široko su rasprostranjene među bakterijama. Do danas je pokazano da organizmi koji sadrže dioksigenaze koje hidroksiliraju prsten mogu rasti na različitim aromatičnim izvorima ugljika, a ovi enzimi su klasifikovani kao NDO (naftalen), toluen dioksigenaza (TDO, toluen) i bifenil dioksigenaza (BPDO, bifenil). I NDO i BPDO mogu katalizirati dvostruku oksidaciju i hidroksilaciju bočnog lanca različitih policikličkih aromatskih ugljikovodika (toluen, nitrotoluen, ksilen, etilbenzen, naftalen, bifenil, fluoren, indol, metilnaftalen, naftalensulfonat, fenantren, antracen, acetofenon, itd.) (Boyd i Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO je višekomponentni sistem koji se sastoji od oksidoreduktaze, feredoksina i komponente oksigenaze koja sadrži aktivno mjesto (Gibson i Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Katalitička jedinica NDO sastoji se od velike α podjedinice i male β podjedinice raspoređenih u α3β3 konfiguraciji. NDO pripada velikoj porodici oksigenaza, a njegova α-podjedinica sadrži Rieskeovo mjesto [2Fe-2S] i mononuklearni nehemski željezo, koji određuje specifičnost supstrata NDO (Parales et al., 1998). Tipično, u jednom katalitičkom ciklusu, dva elektrona iz redukcije piridin nukleotida prenose se na Fe(II) ion u aktivnom mjestu putem reduktaze, feredoksina i Rieskeovog mjesta. Redukcijski ekvivalenti aktiviraju molekularni kisik, što je preduvjet za dihidroksilaciju supstrata (Ferraro et al., 2005). Do danas je samo nekoliko NDO-a pročišćeno i detaljno okarakterizirano iz različitih sojeva, a genetska kontrola puteva uključenih u degradaciju naftalena detaljno je proučena (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Dioksigenaze koje cijepaju prsten (enzimi koji cijepaju endo- ili orto-prsten i enzimi koji cijepaju egzodiol- ili meta-prsten) djeluju na hidroksilirane aromatične spojeve. Na primjer, dioksigenaza koja cijepa orto-prsten je katehol-1,2-dioksigenaza, dok je dioksigenaza koja cijepa meta-prsten katehol-2,3-dioksigenaza (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Pored različitih oksigenaza, postoje i različite dehidrogenaze odgovorne za dehidrogenaciju aromatičnih dihidrodiola, alkohola i aldehida, a koriste NAD+/NADP+ kao akceptore elektrona, koji su neki od važnih enzima uključenih u metabolizam (Gibson i Subramanian, 1984; Shaw i Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Enzimi poput hidrolaza (esteraze, amidaze) su druga važna klasa enzima koji koriste vodu za cijepanje kovalentnih veza i pokazuju široku specifičnost supstrata. Karbaril hidrolaza i druge hidrolaze smatraju se komponentama periplazme (transmembrane) kod gram-negativnih bakterija (Kamini et al., 2018). Karbaril ima i amidnu i estersku vezu; stoga ga može hidrolizirati ili esteraza ili amidaza da bi se formirao 1-naftol. Prijavljeno je da karbaril u soju Rhizobium rhizobium AC10023 i soju Arthrobacter RC100 funkcionira kao esteraza odnosno amidaza. Karbaril u soju Arthrobacter RC100 također funkcionira kao amidaza. Pokazano je da RC100 hidrolizira četiri insekticida klase N-metilkarbamata kao što su karbaril, metomil, mefenaminska kiselina i XMC (Hayaatsu et al., 2001). Prijavljeno je da CH u Pseudomonas sp. C5pp može djelovati na karbaril (100% aktivnosti) i 1-naftil acetat (36% aktivnosti), ali ne i na 1-naftilacetamid, što ukazuje na to da je riječ o esterazi (Trivedi et al., 2016).
Biohemijske studije, obrasci regulacije enzima i genetske analize pokazale su da se geni za razgradnju naftalena sastoje od dvije inducibilne regulatorne jedinice ili "operona": nah („uzvodni put“, koji pretvara naftalen u salicilnu kiselinu) i sal („nizvodni put“, koji pretvara salicilnu kiselinu u centralni ugljični put putem katehola). Salicilna kiselina i njeni analozi mogu djelovati kao induktori (Shamsuzzaman i Barnsley, 1974). U prisustvu glukoze ili organskih kiselina, operon je potisnut. Slika 5 prikazuje kompletnu genetsku organizaciju razgradnje naftalena (u obliku operona). Opisano je nekoliko imenovanih varijanti/oblika gena nah (ndo/pah/dox) i utvrđeno je da imaju visoku homologiju sekvenci (90%) među svim vrstama Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Geni uzvodnog puta naftalena su uglavnom raspoređeni konsenzusnim redoslijedom kao što je prikazano na Slici 5A. Za još jedan gen, nahQ, također je utvrđeno da je uključen u metabolizam naftalena i obično se nalazio između nahC i nahE, ali njegova stvarna funkcija tek treba biti razjašnjena. Slično tome, gen nahY, odgovoran za kemotaksiju osjetljivu na naftalen, pronađen je na distalnom kraju nah operona kod nekih članova. Kod Ralstonia sp., gen U2 koji kodira glutation S-transferazu (gsh) pronađen je između nahAa i nahAb, ali nije utjecao na karakteristike iskorištavanja naftalena (Zylstra et al., 1997).
Slika 5. Genetska organizacija i raznolikost uočena tokom degradacije naftalena među bakterijskim vrstama; (A) Gornji naftalenski put, metabolizam naftalena u salicilnu kiselinu; (B) Donji naftalenski put, salicilna kiselina preko katehola do centralnog ugljikovog puta; (C) salicilna kiselina preko gentizata do centralnog ugljikovog puta.
"Donji put" (sal operon) se obično sastoji od nahGTHINLMOKJ i pretvara salicilat u piruvat i acetaldehid putem puta cijepanja katehol metaringa. Utvrđeno je da je gen nahG (koji kodira salicilat hidroksilazu) konzerviran na proksimalnom kraju operona (Sl. 5B). U poređenju s drugim sojevima koji razgrađuju naftalen, kod P. putida CSV86 nah i sal operoni su tandemski i vrlo blisko povezani (oko 7,5 kb). Kod nekih gram-negativnih bakterija, kao što su Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 i P. putida AK5, naftalen se metabolizira kao centralni ugljikov metabolit putem gentizatnog puta (u obliku sgp/nag operona). Genska kaseta je tipično predstavljena u obliku nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, gdje se nagR (koji kodira regulator tipa LysR) nalazi na gornjem kraju (Slika 5C).
Karbaril ulazi u centralni ugljikov ciklus putem metabolizma 1-naftola, 1,2-dihidroksinaftalena, salicilne kiseline i gentizinske kiseline (Slika 3). Na osnovu genetskih i metaboličkih studija, predloženo je da se ovaj put podijeli na "uzvodni" (konverzija karbarila u salicilnu kiselinu), "srednji" (konverzija salicilne kiseline u gentizinsku kiselinu) i "nizvodni" (konverzija gentizinske kiseline u međuprodukte centralnog ugljikovog puta) (Singh et al., 2013). Genomska analiza C5pp (superkontig A, 76,3 kb) otkrila je da je gen mcbACBDEF uključen u konverziju karbarila u salicilnu kiselinu, nakon čega slijedi mcbIJKL u konverziji salicilne kiseline u gentizinsku kiselinu, te mcbOQP u konverziji gentizinske kiseline u centralne ugljične međuprodukte (fumarat i piruvat, Trivedi et al., 2016) (Slika 6).
Prijavljeno je da enzimi uključeni u razgradnju aromatičnih ugljikovodika (uključujući naftalen i salicilnu kiselinu) mogu biti inducirani odgovarajućim spojevima i inhibirani jednostavnim izvorima ugljika poput glukoze ili organskih kiselina (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Među različitim metaboličkim putevima naftalena i njegovih derivata, regulatorne karakteristike naftalena i karbarila su donekle proučavane. Za naftalen, geni i u uzvodnim i nizvodnim putevima regulirani su NahR-om, trans-aktivirajućim pozitivnim regulatorom tipa LysR. Potreban je za indukciju nah gena salicilnom kiselinom i njegovu naknadnu ekspresiju na visokom nivou (Yen i Gunsalus, 1982). Nadalje, studije su pokazale da su integrativni faktor domaćina (IHF) i XylR (sigma 54-ovisni transkripcijski regulator) također ključni za transkripcijsku aktivaciju gena u metabolizmu naftalena (Ramos et al., 1997). Studije su pokazale da se enzimi puta otvaranja katehol meta-prstenova, naime katehol 2,3-dioksigenaza, indukuju u prisustvu naftalena i/ili salicilne kiseline (Basu et al., 2006). Studije su pokazale da se enzimi puta otvaranja katehol orto-prstenova, naime katehol 1,2-dioksigenaza, indukuju u prisustvu benzojeve kiseline i cis,cis-mukonata (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
U soju C5pp, pet gena, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR i mcbS, kodiraju regulatore koji pripadaju porodici transkripcijskih regulatora LysR/TetR odgovornih za kontrolu degradacije karbarila. Utvrđeno je da je homologni gen mcbG najuže povezan s regulatorom tipa LysR, PhnS (58% identitet aminokiselina), koji je uključen u metabolizam fenantrena kod Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Utvrđeno je da je gen mcbH uključen u međuput (konverzija salicilne kiseline u gentizinsku kiselinu) i pripada transkripcijskom regulatoru tipa LysR, NagR/DntR/NahR kod Pseudomonas i Burkholderia. Prijavljeno je da članovi ove porodice prepoznaju salicilnu kiselinu kao specifičnu efektorsku molekulu za indukciju gena degradacije. S druge strane, tri gena, mcbN, mcbR i mcbS, koji pripadaju transkripcijskim regulatorima tipa LysR i TetR, identificirani su u nizvodnom putu (metaboliti gentizat-centralnog ugljikovog puta).
Kod prokariota, horizontalni procesi prijenosa gena (akvizicija, razmjena ili transfer) putem plazmida, transpozona, profaga, genomskih otoka i integrativnih konjugativnih elemenata (ICE) glavni su uzroci plastičnosti u bakterijskim genomima, što dovodi do sticanja ili gubitka specifičnih funkcija/osobina. To omogućava bakterijama da se brzo prilagode različitim uvjetima okoline, pružajući potencijalne adaptivne metaboličke prednosti domaćinu, kao što je razgradnja aromatičnih spojeva. Metaboličke promjene se često postižu finim podešavanjem operona razgradnje, njihovih regulatornih mehanizama i specifičnosti enzima, što olakšava razgradnju šireg spektra aromatičnih spojeva (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Utvrđeno je da se genske kasete za razgradnju naftalena nalaze na različitim mobilnim elementima kao što su plazmidi (konjugativni i nekonjugativni), transpozoni, genomi, ICE i kombinacije različitih bakterijskih vrsta (Slika 5). Kod Pseudomonas G7, nah i sal operoni plazmida NAH7 su transkribovani u istoj orijentaciji i dio su defektnog transpozona kojem je za mobilizaciju potrebna transpozaza Tn4653 (Sota et al., 2006). Kod soja Pseudomonas NCIB9816-4, gen je pronađen na konjugativnom plazmidu pDTG1 kao dva operona (udaljena približno 15 kb) koji su transkribovani u suprotnim smjerovima (Dennis i Zylstra, 2004). Kod soja Pseudomonas putida AK5, nekonjugativni plazmid pAK5 kodira enzim odgovoran za razgradnju naftalena putem gentizatnog puta (Izmalkova et al., 2013). Kod soja Pseudomonas PMD-1, nah operon se nalazi na hromosomu, dok se sal operon nalazi na konjugativnom plazmidu pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Međutim, kod Pseudomonas stutzeri AN10, svi geni za degradaciju naftalena (nah i sal operoni) nalaze se na hromosomu i vjerovatno se regrutuju putem transpozicije, rekombinacije i preuređenja (Bosch et al., 2000). Kod Pseudomonas sp. CSV86, nah i sal operoni nalaze se u genomu u obliku ICE (ICECSV86). Struktura je zaštićena sa tRNAGly nakon čega slijede direktna ponavljanja koja ukazuju na mjesta rekombinacije/vezivanja (attR i attL) i integraza slična fagu koja se nalazi na oba kraja tRNAGly, te je stoga strukturno slična ICEclc elementu (ICEclcB13 kod Pseudomonas knackmusii za degradaciju hlorokatehola). Prijavljeno je da se geni na ICE mogu prenijeti konjugacijom s izuzetno niskom frekvencijom prijenosa (10-8), čime se svojstva degradacije prenose na primaoca (Basu i Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Većina gena odgovornih za degradaciju karbarila nalazi se na plazmidima. Arthrobacter sp. RC100 sadrži tri plazmida (pRC1, pRC2 i pRC300) od kojih dva konjugativna plazmida, pRC1 i pRC2, kodiraju enzime koji pretvaraju karbaril u gentizat. S druge strane, enzimi uključeni u konverziju gentizata u centralne ugljikove metabolite nalaze se na hromosomu (Hayaatsu et al., 1999). Bakterije roda Rhizobium. Soj AC100, koji se koristi za konverziju karbarila u 1-naftol, sadrži plazmid pAC200, koji nosi gen cehA koji kodira CH kao dio Tnceh transpozona okruženog sekvencama sličnim insercijskim elementima (istA i istB) (Hashimoto et al., 2002). U soju Sphingomonas CF06, vjeruje se da je gen za degradaciju karbarila prisutan u pet plazmida: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 i pCF05. DNK homologija ovih plazmida je visoka, što ukazuje na postojanje duplikacije gena (Feng et al., 1997). U simbiontu koji degradira karbaril, sastavljenom od dvije vrste Pseudomonas, soj 50581 sadrži konjugativni plazmid pCD1 (50 kb) koji kodira gen za mcd karbaril hidrolazu, dok konjugativni plazmid u soju 50552 kodira enzim koji degradira 1-naftol (Chapalamadugu i Chaudhry, 1991). U soju Achromobacter WM111, gen za mcd furadan hidrolazu nalazi se na plazmidu od 100 kb (pPDL11). Pokazano je da je ovaj gen prisutan na različitim plazmidima (100, 105, 115 ili 124 kb) kod različitih bakterija iz različitih geografskih regija (Parekh et al., 1995). Kod Pseudomonas sp. C5pp, svi geni odgovorni za degradaciju karbarila nalaze se u genomu koji obuhvata 76,3 kb sekvence (Trivedi et al., 2016). Analiza genoma (6,15 Mb) otkrila je prisustvo 42 MGE i 36 GEI, od kojih se 17 MGE nalazilo u superkontigu A (76,3 kb) sa prosječnim asimetričnim sadržajem G+C (54–60 mol%), što ukazuje na moguće horizontalne događaje transfera gena (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 pokazuje sličan raspored gena koji degradiraju karbaril, ali ovi geni se nalaze na plazmidu (Zhu et al., 2019).
Pored metaboličke efikasnosti na biohemijskom i genomskom nivou, mikroorganizmi pokazuju i druga svojstva ili odgovore kao što su hemotaksija, svojstva modifikacije ćelijske površine, kompartmentalizacija, preferencijalno korištenje, proizvodnja biosurfaktanata itd., što im pomaže da efikasnije metaboliziraju aromatične zagađivače u kontaminiranim okruženjima (Slika 7).
Slika 7. Različite strategije ćelijskog odgovora idealnih bakterija koje razgrađuju aromatične ugljikovodike za efikasnu biodegradaciju stranih zagađujućih spojeva.
Kemotaktički odgovori se smatraju faktorima koji pojačavaju razgradnju organskih zagađivača u heterogeno zagađenim ekosistemima. (2002) su pokazali da kemotaksija Pseudomonas sp. G7 na naftalen povećava brzinu razgradnje naftalena u vodenim sistemima. Soj divljeg tipa G7 razgrađuje naftalen mnogo brže od mutantnog soja s nedostatkom kemotaksije. Utvrđeno je da je NahY protein (538 aminokiselina s membranskom topologijom) ko-transkribiran s genima metaklavažnog puta na NAH7 plazmidu, i poput transduktora kemotaksije, čini se da ovaj protein funkcionira kao hemoreceptor za razgradnju naftalena (Grimm i Harwood 1997). Druga studija Hansela i suradnika (2009) pokazala je da je protein kemotaktički, ali je njegova brzina razgradnje visoka. (2011) su pokazali kemotaktički odgovor Pseudomonas (P. putida) na plinoviti naftalen, pri čemu je difuzija u plinovitoj fazi rezultirala stalnim protokom naftalena u ćelije, što je kontroliralo kemotaktički odgovor ćelija. Istraživači su iskoristili ovo hemotaktično ponašanje kako bi stvorili mikrobe koji bi povećali brzinu razgradnje. Studije su pokazale da hemosenzorni putevi također regulišu druge ćelijske funkcije kao što su ćelijska dioba, regulacija ćelijskog ciklusa i formiranje biofilma, čime pomažu u kontroli brzine razgradnje. Međutim, iskorištavanje ovog svojstva (hemotaksije) za efikasnu razgradnju otežano je nekoliko uskih grla. Glavne prepreke su: (a) različiti paralogni receptori prepoznaju iste spojeve/ligande; (b) postojanje alternativnih receptora, tj. energetski tropizam; (c) značajne razlike u sekvencama u senzornim domenima iste porodice receptora; i (d) nedostatak informacija o glavnim bakterijskim senzornim proteinima (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Ponekad, biodegradacija aromatičnih ugljikovodika proizvodi više metabolita/intermedijara, koji mogu biti hemotaktični za jednu grupu bakterija, ali odbojni za druge, što dodatno komplikuje proces. Da bismo identificirali interakcije liganada (aromatičnih ugljikovodika) s kemijskim receptorima, konstruirali smo hibridne senzorske proteine ​​(PcaY, McfR i NahY) spajanjem senzorskih i signalnih domena Pseudomonas putida i Escherichia coli, koji ciljaju receptore za aromatične kiseline, TCA međuprodukte i naftalen, respektivno (Luu et al., 2019).
Pod utjecajem naftalena i drugih policikličkih aromatskih ugljikovodika (PAH), struktura bakterijske membrane i integritet mikroorganizama podliježu značajnim promjenama. Studije su pokazale da naftalen ometa interakciju acilnog lanca putem hidrofobnih interakcija, čime se povećava bubrenje i fluidnost membrane (Sikkema et al., 1995). Da bi se suprotstavile ovom štetnom učinku, bakterije reguliraju fluidnost membrane promjenom omjera i sastava masnih kiselina između izo/anteizo masnih kiselina razgranatog lanca i izomerizacijom cis-nezasićenih masnih kiselina u odgovarajuće trans-izomere (Heipieper i de Bont, 1994). Kod Pseudomonas stutzeri uzgojenog na tretmanu naftalenom, omjer zasićenih i nezasićenih masnih kiselina povećao se sa 1,1 na 2,1, dok se kod Pseudomonas JS150 ovaj omjer povećao sa 7,5 na 12,0 (Mrozik et al., 2004). Kada su uzgajane na naftalenu, ćelije Achromobacter KAs 3–5 pokazale su agregaciju ćelija oko kristala naftalena i smanjenje naboja na površini ćelija (sa -22,5 na -2,5 mV) praćeno citoplazmatskom kondenzacijom i vakuolizacijom, što ukazuje na promjene u ćelijskoj strukturi i svojstvima ćelijske površine (Mohapatra et al., 2019). Iako su ćelijske/površinske promjene direktno povezane s boljim usvajanjem aromatičnih zagađivača, relevantne strategije bioinženjeringa nisu u potpunosti optimizirane. Manipulacija oblikom ćelija rijetko se koristila za optimizaciju bioloških procesa (Volke i Nikel, 2018). Brisanje gena koji utiču na diobu ćelija uzrokuje promjene u morfologiji ćelija. Brisanje gena koji utiču na diobu ćelija uzrokuje promjene u morfologiji ćelija. Kod Bacillus subtilis, pokazano je da je protein ćelijske septuma SepF uključen u formiranje septuma i potreban je za naredne korake ćelijske diobe, ali nije esencijalni gen. Delecija gena koji kodiraju peptidne glikanske hidrolaze kod Bacillus subtilis rezultirala je izduživanjem ćelija, povećanom specifičnom brzinom rasta i poboljšanim kapacitetom proizvodnje enzima (Cui et al., 2018).
Predložena je kompartmentalizacija puta degradacije karbarila kako bi se postigla efikasna degradacija sojeva Pseudomonas C5pp i C7 (Kamini et al., 2018). Pretpostavlja se da se karbaril transportuje u periplazmatski prostor kroz septum vanjske membrane i/ili kroz difuzibilne porine. CH je periplazmatski enzim koji katalizira hidrolizu karbarila do 1-naftola, koji je stabilniji, hidrofobniji i toksičniji. CH je lokaliziran u periplazmi i ima nizak afinitet za karbaril, kontrolirajući tako stvaranje 1-naftola, čime sprječava njegovo nakupljanje u ćelijama i smanjuje njegovu toksičnost za ćelije (Kamini et al., 2018). Rezultirajući 1-naftol se transportuje u citoplazmu preko unutrašnje membrane particioniranjem i/ili difuzijom, a zatim se hidroksilira do 1,2-dihidroksinaftalena pomoću enzima 1NH visokog afiniteta za daljnji metabolizam u centralnom ugljikovom putu.
Iako mikroorganizmi imaju genetske i metaboličke sposobnosti za razgradnju ksenobiotičkih izvora ugljika, hijerarhijska struktura njihovog korištenja (tj. preferencijalno korištenje jednostavnih u odnosu na složene izvore ugljika) predstavlja glavnu prepreku biorazgradnji. Prisustvo i korištenje jednostavnih izvora ugljika smanjuje ekspresiju gena koji kodiraju enzime koji razgrađuju složene/nepreferirane izvore ugljika poput PAH-ova. Dobro proučen primjer je da kada se glukoza i laktoza istovremeno daju Escherichia coli, glukoza se efikasnije koristi od laktoze (Jacob i Monod, 1965). Prijavljeno je da Pseudomonas razgrađuje različite PAH-ove i ksenobiotička jedinjenja kao izvore ugljika. Hijerarhija korištenja izvora ugljika kod Pseudomonas je organske kiseline > glukoza > aromatični spojevi (Hylemon i Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Međutim, postoji izuzetak. Zanimljivo je da Pseudomonas sp. CSV86 pokazuje jedinstvenu hijerarhijsku strukturu koja preferencijalno koristi aromatične ugljikovodike (benzojeva kiselina, naftalen, itd.) umjesto glukoze i kometabolizira aromatične ugljikovodike s organskim kiselinama (Basu et al., 2006). Kod ove bakterije, geni za razgradnju i transport aromatičnih ugljikovodika nisu smanjeno regulirani čak ni u prisustvu drugog izvora ugljika kao što su glukoza ili organske kiseline. Kada se uzgaja u mediju s glukozom i aromatičnim ugljikovodicima, uočeno je da su geni za transport i metabolizam glukoze smanjeno regulirani, aromatični ugljikovodici su korišteni u prvoj log fazi, a glukoza je korištena u drugoj log fazi (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). S druge strane, prisustvo organskih kiselina nije utjecalo na ekspresiju metabolizma aromatičnih ugljikovodika, pa se očekuje da će ova bakterija biti kandidatski soj za studije biodegradacije (Phale et al., 2020).
Dobro je poznato da biotransformacija ugljikovodika može uzrokovati oksidativni stres i pojačanu regulaciju antioksidativnih enzima u mikroorganizmima. Neefikasna biodegradacija naftalena, kako u stacionarnoj fazi ćelija, tako i u prisustvu toksičnih spojeva, dovodi do stvaranja reaktivnih vrsta kisika (ROS) (Kang et al. 2006). Budući da enzimi koji razgrađuju naftalen sadrže klastere željeza i sumpora, pod oksidativnim stresom, željezo u hemu i proteinima željeza i sumpora će se oksidirati, što dovodi do inaktivacije proteina. Ferredoksin-NADP+ reduktaza (Fpr), zajedno sa superoksid dismutazom (SOD), posreduje u reverzibilnoj redoks reakciji između NADP+/NADPH i dva molekula feredoksina ili flavodoksina, čime se uklanjaju ROS i obnavlja centar željeza i sumpora pod oksidativnim stresom (Li et al. 2006). Prijavljeno je da i Fpr i SodA (SOD) kod Pseudomonas mogu biti izazvani oksidativnim stresom, a povećana aktivnost SOD i katalaze uočena je kod četiri soja Pseudomonas (O1, W1, As1 i G1) tokom rasta u uslovima dodatka naftalena (Kang et al., 2006). Studije su pokazale da dodavanje antioksidanata poput askorbinske kiseline ili željeza (Fe2+) može povećati brzinu rasta naftalena. Kada je Rhodococcus erythropolis rastao u naftalenskom mediju, transkripcija gena citohroma P450 povezanih s oksidativnim stresom, uključujući sodA (Fe/Mn superoksid dismutaza), sodC (Cu/Zn superoksid dismutaza) i recA, bila je povećana (Sazykin et al., 2019). Komparativna kvantitativna proteomska analiza ćelija Pseudomonas kultiviranih u naftalenu pokazala je da je pojačana regulacija različitih proteina povezanih s odgovorom na oksidativni stres strategija suočavanja sa stresom (Herbst et al., 2013).
Prijavljeno je da mikroorganizmi proizvode biosurfaktante pod djelovanjem hidrofobnih izvora ugljika. Ovi surfaktanti su amfifilni površinski aktivni spojevi koji mogu formirati agregate na granicama ulje-voda ili zrak-voda. To potiče pseudo-solubilizaciju i olakšava adsorpciju aromatskih ugljikovodika, što rezultira efikasnom biodegradacijom (Rahman et al., 2002). Zbog ovih svojstava, biosurfaktanti se široko koriste u raznim industrijama. Dodavanje hemijskih surfaktanata ili biosurfaktanata bakterijskim kulturama može poboljšati efikasnost i brzinu degradacije ugljikovodika. Među biosurfaktantima, ramnolipidi koje proizvodi Pseudomonas aeruginosa su opsežno proučavani i karakterizirani (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Pored toga, druge vrste biosurfaktanata uključuju lipopeptide (mucine iz Pseudomonas fluorescens), emulgator 378 (iz Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg i Ron, 1999), trehaloza disaharid lipide iz Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lihenin iz Bacillusa (Saraswathy i Hallberg, 2002) i surfaktant iz Bacillus subtilis (Siegmund i Wagner, 1991) i Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Pokazalo se da ovi snažni surfaktanti smanjuju površinsku napetost sa 72 dyna/cm na manje od 30 dyna/cm, što omogućava bolju apsorpciju ugljikovodika. Prijavljeno je da Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia i druge bakterijske vrste mogu proizvoditi različite biosurfaktante na bazi ramnolipida i glikolipida kada se uzgajaju u naftalenskim i metilnaftalenskim medijima (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 može proizvesti ekstracelularni biosurfaktant Biosur-Pm kada se uzgaja na aromatičnim spojevima kao što je naftojeva kiselina (Phale et al., 1995). Kinetika formiranja Biosur-Pm pokazala je da je njegova sinteza proces koji zavisi od rasta i pH. Utvrđeno je da je količina Biosur-Pm koju proizvode ćelije pri neutralnom pH bila veća nego pri pH 8,5. Ćelije uzgajane pri pH 8,5 bile su hidrofobnije i imale su veći afinitet za aromatična i alifatska jedinjenja od ćelija uzgajanih pri pH 7,0. Kod Rhodococcus spp. N6, viši odnos ugljika i dušika (C:N) i ograničenje željeza su optimalni uvjeti za proizvodnju ekstracelularnih biosurfaktanata (Mutalik et al., 2008). Učinjeni su pokušaji poboljšanja biosinteze biosurfaktanata (surfaktina) optimizacijom sojeva i fermentacije. Međutim, titar surfaktanata u mediju za kulturu je nizak (1,0 g/L), što predstavlja izazov za proizvodnju velikih razmjera (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Stoga su korištene metode genetskog inženjeringa za poboljšanje njegove biosinteze. Međutim, njegova inženjerska modifikacija je teška zbog velike veličine operona (∼25 kb) i složene biosintetske regulacije kvorum sensing sistema (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Brojne modifikacije genetskim inženjeringom provedene su na bakterijama Bacillus, uglavnom s ciljem povećanja proizvodnje surfaktina zamjenom promotora (srfA operona), prekomjernom ekspresijom proteina za izvoz surfaktina YerP i regulatornih faktora ComX i PhrC (Jiao et al., 2017). Međutim, ove metode genetskog inženjeringa postigle su samo jednu ili nekoliko genetskih modifikacija i još nisu dostigle komercijalnu proizvodnju. Stoga je potrebno daljnje proučavanje metoda optimizacije zasnovanih na znanju.
Studije biodegradacije PAH-ova uglavnom se provode u standardnim laboratorijskim uvjetima. Međutim, na kontaminiranim mjestima ili u kontaminiranom okruženju, pokazano je da mnogi abiotički i biotički faktori (temperatura, pH, kisik, dostupnost hranjivih tvari, bioraspoloživost supstrata, drugi ksenobiotici, inhibicija krajnjeg produkta itd.) mijenjaju i utječu na degradacijski kapacitet mikroorganizama.
Temperatura ima značajan utjecaj na biodegradaciju PAH-ova. Kako temperatura raste, koncentracija rastvorenog kisika se smanjuje, što utječe na metabolizam aerobnih mikroorganizama, budući da im je potreban molekularni kisik kao jedan od supstrata za oksigenaze koje provode reakcije hidroksilacije ili cijepanja prstena. Često se napominje da povišena temperatura pretvara matične PAH-ove u toksičnija jedinjenja, čime se inhibira biodegradacija (Muller et al., 1998).
Primijećeno je da mnoga mjesta kontaminirana PAH-ovima imaju ekstremne pH vrijednosti, kao što su mjesta kontaminirana kiselim rudničkim drenažom (pH 1–4) i mjesta gasifikacije prirodnog plina/uglja kontaminirana alkalnom procjednom vodom (pH 8–12). Ovi uvjeti mogu ozbiljno utjecati na proces biodegradacije. Stoga se prije upotrebe mikroorganizama za bioremedijaciju preporučuje podešavanje pH vrijednosti dodavanjem odgovarajućih hemikalija (s umjerenim do vrlo niskim oksidacijsko-redukcijskim potencijalom) kao što su amonijum sulfat ili amonijum nitrat za alkalna tla ili kalcifikacija kalcijum karbonatom ili magnezijum karbonatom za kisela mjesta (Bowlen et al. 1995; Gupta i Sar 2020).
Snabdijevanje kisikom pogođenog područja je faktor koji ograničava brzinu biodegradacije PAH-ova. Zbog redoks uslova okoline, procesi bioremedijacije in situ obično zahtijevaju uvođenje kisika iz vanjskih izvora (obrada tla, prskanje zrakom i dodavanje hemikalija) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) su pokazali da dodavanje magnezijum peroksida (spoja koji oslobađa kisik) u kontaminirani vodonosnik može efikasno bioremedijirati BTEX spojeve. Druga studija istraživala je in situ degradaciju fenola i BTEX-a u kontaminiranom vodonosniku ubrizgavanjem natrijum nitrata i izgradnjom bunara za ekstrakciju kako bi se postigla efikasna bioremedijacija (Bewley i Webb, 2001).