Sadašnjost†Trenutna adresa: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Centar za elektronsko biološko snimanje.
Kompleks 1 za sakupljanje svjetlosti (RC-LH1) reakcijskog centra je osnovna fotosintetska komponenta ljubičastih fototrofnih bakterija. Predstavili smo dvije krioelektronsko-mikroskopske strukture RC-LH1 kompleksa iz Rhodopseudomonas palustris. Struktura rezolucije od 2,65 Å RC-LH114-W kompleksa sastoji se od 14 podjedinica LH1 petlji koje okružuju RC, koji je prekinut proteinom W, dok je kompleks bez proteina W potpuno RC sastava okružen RC. Zatvorena LH1 petlja od 16 podjedinica. Poređenje ovih struktura pruža uvid u dinamiku kinona u RC-LH1 kompleksu, uključujući prethodno neodređene konformacijske promjene pri vezivanju kinona na RC QB mjestu, kao i lokaciju pomoćnih mjesta vezivanja kinona, koja pomažu u njihovom prenosu na RC. Jedinstvena struktura W proteina sprječava zatvaranje LH1 petlje, čime se stvara kanal za ubrzavanje razmjene kinona/kinolona.
Energija koju obezbjeđuje fotosinteza može održati gotovo sav život na Zemlji i ima veliki potencijal za solarnu biotehnologiju. Dok promoviraju globalnu fotosintezu, ljubičaste fototrofne bakterije također pokazuju različite energetske načine i metaboličke sposobnosti. One mogu izbjeći fotosintezu i rasti kao heterotrofne bakterije u mraku, mogu fiksirati dušik i ugljikov dioksid, proizvoditi vodik i razgrađivati ​​aromatične spojeve (1-3). Da bi se osigurala energija za ove procese, svjetlost se mora brzo i efikasno pretvoriti u hemijsku energiju. Ovaj proces počinje kada kompleks antene za hvatanje svjetlosti apsorbira svjetlost i prenosi zarobljenu energiju u reakcijski centar (RC), čime se pokreće razdvajanje naboja (4-7). Osnovna jedinica fotosinteze kod ljubičastih fototrofnih bakterija sastoji se od RC tipa 2, okruženog kompleksom za sakupljanje svjetlosti 1 (LH1), formirajući jezgro kompleksa RC-LH1. LH1 je formiran nizom zakrivljenih αβ heterodimera, od kojih svaki veže dvije molekule bakterijskog klorofila (BChl) a i jedan ili dva karotenoida (8-12). Najjednostavnija LH1 antena sastoji se od 16 ili 17 αβ heterodimera koji okružuju RC (9-13) u zatvorenoj petlji, ali u drugim osnovnim kompleksima, transmembranski peptidi prekidaju kontinuitet okolnog LH1, čime se potiče difuzija kinola/kinona između RC i citohrom bc1 kompleksa (11, 13-15). Ljubičasta fototrofna biljka Rhodopseudomonas (Rps.) je modelni organizam koji može razumjeti prijenos energije i elektrona koji podržava fotosintezu. Prva kristalna struktura Rps. Model palustris RC-LH1 kompleksa je RC, okružen sa 15 heterodimernih LH1 petlji, koje su prekinute nepoznatim proteinom nazvanim "Protein W" (14). Protein-W je naknadno identificiran kao RPA4402, koji je nekarakterizirani protein od 10,5 kDa sa tri predviđene transmembranske heliksa (TMH) (16). Predlažemo preimenovanje gena rpa4402 koji kodira protein W u pufW kako bi bio u skladu s nomenklaturom koja se koristi za gene koji kodiraju RC-L, M (pufL, pufM) i LH1α, β (pufA, pufB) podjedinice. Zanimljivo je da je protein-W prisutan samo u oko 10% RC-LH1, što otkriva da Rps. palustris proizvodi dva različita RC-LH1 kompleksa. Ovdje izvještavamo o visokorezolucijskim krio-EM (cryo-EM) strukturama dva osnovna kompleksa, jednom s proteinom W i 14 αβ heterodimera, a drugom bez proteina W i zatvorenom LH1 petljom od 16 heterodimera. Naša struktura predstavlja korak naprijed u razumijevanju RC-LH1 kompleksa Rps. palustris, jer smo analizirali homogenu populaciju svake varijante i imamo dovoljnu rezoluciju da jasno dodijelimo svaki peptid i vezane pigmente te srodne lipide i kinone. Poređenje ovih struktura pokazuje da tri TMH proteina-W, koja do sada nisu pronađena ni u jednom drugom RC-LH1 kompleksu, generišu kinonski kanal kako bi ubrzali izmjenu kinona/kinolona. Identificiran je niz konzerviranih mjesta vezivanja lipida i kinona, a otkrili smo i novu konformacijsku promjenu nakon kombinacije kinona i RC, koja može biti pogodna za RC fotosistema II (PSII) oksigeniranih fototrofnih organizama. Naši nalazi pružaju nove uvide u kinetiku vezivanja i izmjenu kinona/kinolona u RC-LH1 osnovnom kompleksu ljubičastih fototrofnih bakterija.
Kako bismo olakšali detaljno proučavanje dva kompleksa pronađena u Rps. palustris, izolirali smo svaki RC-LH1 biohemijskim metodama. Kompleks s nedostatkom proteina W (u daljnjem tekstu ΔpufW) pročišćen je iz soja kojem nedostaje gen pufW (16), i može se proizvesti samo jedan RC-LH1 kompleks. Kompleks koji sadrži protein W proizvodi soj. Protein W ovog soja je modificiran s 10x His oznakom na svom C-terminusu, tako da se kompleks koji sadrži protein W može efikasno kombinirati s proteinom W kojem najviše nedostaje imobilizacijom metala. Kompleks se efikasno odvaja (16) afinitetnom hromatografijom (IMAC).
Kao što je prikazano na Slici 1, oba kompleksa sadrže RC s tri podjedinice (RC-L, RC-M i RC-H) okružene LH1 antenom. Struktura od 2,80 Å kompleksa kojem nedostaje protein-W pokazuje 16 αβ heterodimera, koji formiraju zatvorenu LH1 petlju koja potpuno okružuje RC, u daljnjem tekstu RC-LH116 kompleks. Struktura od 2,65 Å kompleksa koji sadrži protein-W ima 14-heterodimer LH1 prekinut proteinom-W, u daljnjem tekstu RC-LH114-W.
(A i B) Površinski prikaz spoja. (C i D) Vezani pigmenti izraženi u štapićima. (E i F) Kompleksi posmatrani sa citoplazmatske površine imaju peptide i LH1 podjedinice predstavljene crtežima i numerisani su u smjeru kazaljke na satu od protein-W jaza [u skladu sa numerisanjem Rba. sphaeroides kompleks (13)]. Za LH1-α, boja proteinske podjedinice je žuta; za LH1-β, boja proteinske podjedinice je plava; za protein-W, protein je crven; za RC-H, on je cijan; za RC-L, on je narandžast; za RC-M, magenta. Kofaktori su predstavljeni štapićima, zelena predstavlja molekule BChl i BPh a, ljubičasta predstavlja karotenoide, a žuta predstavlja molekule UQ10. (G i H) Uvećani prikaz protein-W jaza u ekvivalentnoj regiji RC-LH114-W kompleksa (G) i RC-LH116 kompleksa (H). Kofaktori su prikazani u obliku popunjavanja prostora, helirani kinon je prikazan plavom bojom. Praznina protein-W je označena plavom isprekidanom linijom u (G), a male rupe gdje kinon/kinolol difundira na LH116 prstenu su označene crnom isprekidanom linijom u (H).
Slika 1 (A i B) prikazuje RC okružen otvorenim ili zatvorenim nizovima LH1αβ heterodimera, od kojih svaki veže dva BChl i jedan karotenoid (Slika 1, C i D). Prethodne studije su pokazale da je Rps LH1 kompleks. U biosintetskom putu spirulina ksantina, ove vrste sadrže mješovite populacije karotenoida (17). Međutim, spiropiroksantin je dominantni karotenoid i njegova gustoća je zadovoljavajuća. Stoga smo odlučili modelirati spiroksantin na svim mjestima vezivanja LH1. Alfa i beta polipeptidi su pojedinačni TMH s kratkim vanjskim regijama membrane (Slika 1, A, B, E i F). Iako gustoća 17 ostataka na C-terminusu nije uočena, alfa polipeptid je cijepan od Met1 do Ala46 u oba kompleksa. β polipeptid je reduciran od Gly4 do Tyr52 u RC-LH116, a od Ser5 do Tyr52 u RC-LH114-W. Nije uočena gustoća od 3 ili 4 N-terminalna ili 13 C-terminalnih ostataka (Slika S1). Analiza masene spektrometrije miješanog RC-LH1 kompleksa pripremljenog iz soja divljeg tipa pokazala je da je nedostajuća regija rezultat heterolognog cijepanja ovih peptida (Slika S1 i S2). Također je uočena N-terminalna formilacija α-Met1 (f). Analiza je pokazala da se α-peptid sastoji od ostataka fMet1 do Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, a β-peptid se sastoji od ostataka Ser2 do Ala53, što je u dobrom skladu s mapom gustoće EM na niskim temperaturama.
Koordinacija α-His29 i β-His36 čini BChls orijentisanim licem u lice; svaki αβ heterodimer se sastavlja sa svojim susjedima formirajući otvorenu petlju (RC-LH114-W) ili zatvorenu petlju (RC-LH116) oko RC ekscitonski spregnutog pigmentnog niza (Slika 1, C i D). U poređenju sa pojasom od 877 nm RC-LH114-W, apsorpcioni crveni pomak RC-LH116 na 880 nm je 3 nm (Slika 2A). Međutim, spektar kružnog dikroizma je gotovo isti (Slika 2B), što ukazuje da, iako postoji jasna razlika između otvorenih i zatvorenih petlji, lokalno okruženje BChls je vrlo slično. Apsorpcioni crveni pomak može biti rezultat smanjenog termičkog kretanja i povećane stabilnosti na zatvorenoj petlji (18, 19), promjene u vezivanju pigmenata uzrokovane zatvorenom petljom (20, 21) ili kombinacije ova dva efekta (11).
(A) Apsorpcijski spektar ultraljubičastog/vidljivog/bliskog infracrvenog zračenja, čiji su vrhovi označeni odgovarajućim pigmentima i normalizirani na BPh vrh na 775 nm. (B) Spektar kružnog dikroizma normaliziran na apsorbanciju BChl na 805 nm. (C i D) Odabrani ΔA spektri iz vremenski razlučenih apsorpcijskih spektara RC-LH114-W kompleksa (C) i RC-LH116 kompleksa (D). Radi bolje usporedbe, svi spektri su normalizirani na ∆A od −A pri 0,2 ps. (E) Brzina oksidacije citokroma c2 nakon ozračivanja u prisustvu različitih koncentracija UQ2 (vidi Sliku S8 za sirove podatke). (F) U ćelijama uzgojenim pod svjetlošću niskog, srednjeg ili visokog intenziteta (10, 30 ili 300μMm-2 s-1, respektivno), proteinske W i RC-L podjedinice u pročišćenom kompleksu i omjer odvojenih membrana. Odredite nivo proteina elektroforezom na SDS-poliakrilamidnom gelu i imunotestom (pogledajte sliku S9 za sirove podatke). Odredite odnos u odnosu na prečišćeni RC-LH114-W kompleks. Stehiometrijski odnos RC-L i protein-W kompleksa je 1:1.
BChl-ovi na poziciji 1 u deformiranoj αβ14 petlji RC-LH114-W (Slika 1, A, C i E) su bliži primarnom donoru RC (P) za 6,8 Å nego ekvivalentni BChl-ovi u RC-LH116 (Slika 1, B, D i F, i Slika S3); međutim, kinetika tranzijentne apsorpcije dva kompleksa pokazuje da su za RC-LH114-W i RC-LH116 vremenske konstante prijenosa energije pobuđivanja od LH1 do RC 40 ± 4 i 44 ± 3 ps (Slika 2). , C i D, Slika S4 i Tabela S2). Također nema značajne razlike u prijenosu elektrona unutar RC (Slika S5 i povezani dodatni tekst). Sumnjamo da je bliska podudarnost vremena prijenosa energije između LH1 i RC-P posljedica slične udaljenosti, ugla i potencijalne energije većine BChl-ova u dvije LH1 petlje. Izgleda da istraživanje energetskog obrasca LH1 radi postizanja minimalne udaljenosti nije brže od direktnog prijenosa energije sa suboptimalnih mjesta na RC. Otvorena LH1 petlja u RC-LH114-W može također podlijegati beznačajnom termičkom kretanju pod uvjetima niske temperature za strukturnu analizu, a postoji duža konformacija αβ14 prstena na sobnoj temperaturi od udaljenosti pigmentacije βBChls na poziciji RC1.
Kompleks RC-LH116 sadrži 32 BChl i 16 karotenoida, a njegov ukupni raspored je isti kao onaj dobijen iz Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Banka proteinskih podataka (PDB) ID 5Y5S] (9), soja Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) i zelenih algi (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Nakon poravnanja, uočena su samo mala odstupanja u položajima αβ heterodimera, posebno 1-5, 15 i 16 (Slika S6). Prisustvo proteina-W ima značajan uticaj na strukturu LH1. Njegova tri TMH su povezana kratkim petljama, sa N-terminalom na lumenskoj strani kompleksa i C-terminalom na citoplazmatskoj strani (Slike 1A i 3, A do D). Protein-W je uglavnom hidrofoban (Slika 3B), a TMH2 i TMH3 interaguju sa LH1αβ-14 formirajući transmembransku površinu (Slika 3, B i E do G). Interfejs se uglavnom sastoji od ostataka Phe, Leu i Val u transmembranskoj regiji. Ovi ostaci su složeni sa hidrofobnim aminokiselinama i αβ-14 pigmentima. Neki polarni ostaci također doprinose interakciji, uključujući vodikovu vezu između W-Thr68 i β-Trp42 na površini kompleksne šupljine (Slika 3, F i G). Na površini citoplazme, Gln34 se nalazi uz keto grupu αβ-14 karotenoida. Osim toga, molekula n-dodecil β-d-maltozida (β-DDM) je razdvojena, a njen hidrofobni rep se produžio do interfejsa između proteina-W i αβ-14, a lipidni rep se može nalaziti u tijelu. Također smo primijetili da su C-terminalne regije razdvajanja proteina W i RCH vrlo blizu, ali ne u okviru formiranja specifičnih interakcija (Slika 1, A i E). Međutim, moguće su interakcije u nerazriješenim C-terminalnim aminokiselinama ova dva proteina, što može pružiti mehanizam za regrutaciju proteina-W tokom sklapanja RC-LH114-W kompleksa.
(A) Protein-W, koji je okrenut prema granici sa LH1αβ14 u crtanom obliku, ima bočni lanac u obliku štapića (crveno), prikazan u dijelu dijagrama elektrostatičkog potencijala (prozirna siva površina s nivoom konture od 0,13). (B) Protein-W predstavljen hidrofobnom obojenom površinom. Polarna i nabijena područja prikazana su cijan bojom, hidrofobna područja prikazana su bijelom, a jako hidrofobna područja prikazana su narandžastom bojom. (C i D) Protein-W predstavljen u crtanom prikazu, njegova orijentacija je ista kao u (A) (C) i rotiran je za 180° (D). Prema položaju u sekvenci, prepoznatljivi ostaci usvajaju duginu shemu boja, gdje je N-terminal plav, a C-terminal crven. (E) Protein-W u istom prikazu kao u (A), a ostaci na granici protein-W:LH1 predstavljeni su štapićima s pričvršćenim oznakama. (F) Protein-W je rotiran za 90° u odnosu na (E) i LH1αβ14 u crtanom prikazu i u odnosu na ostatke na granici u stupčastom prikazu. Previseći ostaci beta polipeptida su označeni. Kofaktor je prikazan kao traka koja odgovara boji Slike 1, razgrađeni β-DDM je prikazan sivo, a kisik je prikazan crveno. (G) Pogled u (F) je rotiran za 180°, s istaknutim ostacima označenog alfa polipeptida.
Protein-W zamjenjuje αβ heterodimer (15. na slici 1F), čime sprječava zatvaranje petlje i naginjanje prva tri αβ heterodimera. Uočeno je da je maksimalni ugao nagiba prvog αβ-1 heterodimera u odnosu na normalu filma bio 25° do 29° (Slika 1, A i E), što je formirano nagibom αβ-1 od 2° do 8° u RC A oštrom kontrastu-LH116 (Slika 1, B i F). Drugi i treći heterodimer su nagnuti pod uglom od 12° do 22° i 5° do 10°, respektivno. Zbog sterne smetnje RC, nagib αβ-1 ne uključuje drugi par αβ (koji odgovara 16. αβ na slici 1F), formirajući tako jasan jaz u LH1 prstenu (Slika 1, A i E). Zbog nedostatka dva αβ heterodimera, praćenog gubitkom četiri BChl i dva karotenoida, nijedan od karotenoida se ne veže za uvijenu αβ-1 podjedinicu, što rezultira LH114-W prstenom koji sadrži 13 vegetarijanskih karotenoida i 28 BChl. Procjene lokalne rezolucije dva kompleksa u αβ1 do 7 regijama su niže od onih za ostatak LH1 petlje, što može odražavati inherentnu plastičnost LH1 podjedinice uz RC QB mjesto (Slika 4).
Slike RC-LH114-W (A i B) i RC-LH116 (C i D) prikazane su iz istog pogleda odozgo/bočnog pogleda (A i B) (A i C) i površine šupljine kao na Sl. 1. (B i D). Obojene tipke su prikazane s desne strane.
Jedini drugi karakteristični osnovni kompleks sa stehiometrijskim odnosom od 1:14 je dimer Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Međutim, protein W i PufX nemaju očiglednu homologiju i imaju značajan utjecaj na svoje odgovarajuće LH1 strukture. PufX je jedan TMH sa N-terminalnim citoplazmatskim domenom koji interaguje sa citoplazmatskom stranom RC-H podjedinice (13) na poziciji koja odgovara Rps. palustris LH116αβ-16. PufX stvara kanal za izmjenu kinona/kinolona između RC-LH1 i citohrom bcl kompleksa i prisutan je u svim osnovnim kompleksima Rba. sphaeroides (13). Iako se monomer-monomerni interfejs nalazi u Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX se nalazi na poziciji vezivanja proteina W u RC-LH114-W, a jaz izazvan PufX-om i proteinom-W je na ekvivalentnoj poziciji (Slika S7A). Jaz u RC-LH114-W je također poravnat sa hipotetičkim kinonskim kanalom (8) Pseudomonas rosea LH1, koji je formiran peptidima koji nisu povezani sa proteinom W ili PufX-om (Slika S7B). Pored toga, kinonski kanal u Blc. Smaragdno zeleni LH1 formiran isključivanjem jedne γ podjedinice (7) nalazi se na sličnoj poziciji (Slika S7C). Iako posredovan različitim proteinima, pojava ovih kinonskih/kinololnih kanala na zajedničkoj poziciji u RC-LH1 kompleksu čini se primjerom konvergentne evolucije, što ukazuje na to da jaz koji stvara protein W može djelovati kao kinonski kanal.
Praznina u LH114-W petlji omogućava formiranje kontinuiranog membranskog područja između unutrašnjeg prostora RC-LH114-W kompleksa i glavne membrane (Slika 1G), umjesto povezivanja dva domena kroz proteinsku poru kao kod proteina. RC-LH116 kompleks je sličan zatvorenom Tch. Igličastom kompleksu (22) (Slika 1H). Budući da je difuzija kinona kroz membranu brža od difuzije kroz uski proteinski kanal, otvorena LH114-W petlja može omogućiti brži promet RC nego zatvorena LH116 petlja, a difuzija kinona u RC može biti ograničenija. Kako bismo testirali da li protein W utiče na konverziju kinona kroz RC, izvršili smo test oksidacije citohroma na određenoj koncentraciji ubikinona 2 (UQ2) (analog prirodnog UQ10 sa kraćim izoprenskim repom) (Slika 2E). Iako prisustvo heliranog kinona otežava precizno određivanje prividne Michaelisove konstante (RC-LH114-W i RC-LH116 su pogodni za 0,2±0,1μM i 0,5±0,2μM, respektivno), maksimalna brzina RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) je 28±5% veća od RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
U početku smo procijenili da je protein-W prisutan u oko 10% jezgra kompleksa (16); ovdje su stope popunjenosti ćelija rasta pri slabom, srednjem i jakom svjetlu 15±0,6%, 11±1% i 0,9±0,5, respektivno % (Slika 2F). Kvantitativna usporedba masene spektrometrije pokazala je da dodatak histidinske oznake nije smanjio relativnu zastupljenost proteina-W u usporedbi sa sojevima divljeg tipa (P = 0,59), tako da ovi nivoi nisu artefakt modificiranog proteina-W (Slika S10). Međutim, ova niska popunjenost proteina-W u RC-LH1 kompleksu može omogućiti nekim RC-ima da se ubrzano okreću, čime se ublažava sporija izmjena kinona/kinolona u RC-LH116 kompleksu. Primijetili smo da je stopa popunjenosti pri jakom svjetlu u suprotnosti s nedavnim transkriptomskim podacima, što ukazuje na to da se ekspresija gena pufW povećava pod jakim svjetlom (Slika S11) (23). Razlika između transkripcije pufW i ugradnje proteina-W u RC-LH1 kompleks je zbunjujuća i može odražavati kompleksnu regulaciju proteina.
U RC-LH114-W, 6 kardiolipina (CDL), 7 fosfatidilholina (POPC), 1 fosfatidilglicerol (POPG) i 29 β-DDM molekula su alocirani i modelirani u njemu 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG i 12 βDDM. RC-LH116 (Slika 5, A i B). U ove dvije strukture, CDL se gotovo nalazi na citoplazmatskoj strani kompleksa, dok su POPC, POPG i β-DDM uglavnom smješteni na luminalnoj strani. Dva lipidna i deterdžentna molekula su izolovana u αβ-1 do αβ-6 regiji RC-LH114-W kompleksa (Slika 5A), a pet je izolovano u ekvivalentnoj regiji RC-LH116 (Slika 5B). Više lipida je pronađeno na drugoj strani kompleksa, uglavnom CDL, akumuliranih između RC i αβ-7 do αβ-13 (Slika 5, A i B). Drugi strukturno razdvojeni lipidi i deterdženti nalaze se izvan LH1 prstena, a dobro razdvojeni acilni lanci protežu se između LH1 podjedinica, okvirno označenih kao β-DDM u RC-LH114-W, i definiranih kao β-DDM u RC A mješavini β-DDM i POPC-LH116. Slični položaji helirajućih lipida i deterdženata u našoj strukturi ukazuju na to da su oni fiziološki relevantna mjesta vezivanja (Slika S12A). Položaji ekvivalentnih molekula u Tch također imaju dobru konzistentnost. Nježni i Trv. Soj 970 RC-LH1s (Slika S12, B do E) (9, 12) i ostaci vodikovih veza lipidne glavne grupe pokazali su prilično dobru očuvanost u poravnanju sekvenci (Slika S13), što ukazuje na to da Konzervirani CDL koji se veže za RC (24), ova mjesta mogu biti očuvana u RC-LH1 kompleksu.
(A i B) RC-LH114-W (A) i RC-LH116 (B) peptidi su predstavljeni crtanim slikama, a pigmenti su predstavljeni štapićima, koristeći shemu boja na Slici 1. Lipidi su prikazani crvenom bojom, a deterdženti sivom. UQ vezan za RC QA i QB mjesta je žut, dok je izolovani UQ plav. (C i D) Isti prikazi kao (A) i (B), s izostavljenim lipidima. (E do G) Uvećani prikaz Q1(E), Q2(F) i Q3(G) iz RC-LH116, s bočnim lancima koji utječu jedan na drugi. Vodikove veze su prikazane kao crne isprekidane linije.
U RC-LH116, i RC QA i QB UQ, koji učestvuju u prijenosu elektrona u procesu razdvajanja naboja, razloženi su na svojim mjestima vezivanja. Međutim, u RC-LH114-W, QB kinon nije razlučen i bit će detaljno razmotren u nastavku. Pored QA i QB kinona, dva helirana UQ molekula (smještena između RC i LH1 prstenova) su raspoređena u strukturi RC-LH114-W prema njihovim dobro razlučenim glavnim grupama (smještenim u Q1 i Q2, respektivno). Slika 5C). Dvije izoprenske jedinice su dodijeljene Q1, a mapa gustoće razlučuje svih 10 izoprenskih repova Q2. U strukturi RC-LH116, razlučena su tri helirana UQ10 molekula (Q1 do Q3, slika 5D), a svi molekuli imaju jasnu gustoću kroz cijeli rep (slika 5, D do G). U ove dvije strukture, položaji kinonskih glavnih grupa Q1 i Q2 imaju odličnu konzistentnost (Slika S12F) i interaguju samo sa RC. Q1 se nalazi na ulazu u W jaz RC-LH114-W (Slika 1G i 5, C, D i E), a Q2 se nalazi blizu mjesta vezivanja QB (Slika 5, C, D) i F). Konzervirani ostaci L-Trp143 i L-Trp269 su vrlo blizu Q1 i Q2 i pružaju potencijalne π-stacking interakcije (Slika 5, E i F, i Slika S12). L-Gln88, 3,0 Å od distalnog kisika Q1, pruža jaku vodikovu vezu (Slika 5E); ovaj ostatak je konzerviran u svim RC osim najudaljenijeg odnosa (Slika S13). L-Ser91 je konzervativno supstituiran za Thr u većini drugih RC-ova (Slika S13), udaljen je 3,8 Å od metil kisika Q1 i može osigurati slabe vodikove veze (Slika 5E). Čini se da Q3 nema specifičnu interakciju, ali se nalazi u hidrofobnoj regiji između RC-M podjedinice i LH1-α podjedinice 5 do 6 (Slika 5, D i G). Q1, Q2 i Q3 ili obližnji helirani kinoni također su razlučeni u Tch. Gentle, Trv. Strain 970 i Blc. Struktura irisa (9, 10, 12) ukazuje na konzervirano pomoćno mjesto vezivanja kinona u RC-LH1 kompleksu (Slika S12G). Pet dekomponovanih UQ u RC-LH116 su u dobrom slaganju sa 5,8±0,7 svakog kompleksa određenih visokoefikasnom tečnom hromatografijom (HPLC), dok su tri dekomponovana UQ u RC-LH114-W niža od Izmjerena vrijednost od 6,2±0,3 (Sl. S14) ukazuje na to da u strukturi postoje nerazriješeni UQ molekuli.
Pseudo-simetrični L i M polipeptidi sadrže po pet TMH i formiraju heterodimer koji kombinuje jedan BChl dimer, dva BChl monomera, dva bakteriofagna (BPh) monomera i jedan ne-hemski željezo i jedan ili dva UQ10 molekula. Zbog prisustva vodoničnih veza na terminalnoj ketonskoj grupi i njegovog poznatog nakupljanja u Rps, karotenoidi su ugrađeni u M-podjedinicu, koja se naziva cis-3,4-dehidroorhodopin. Vrste (25). Domen vanjske membrane RC-H je usidren za membranu pomoću jednog TMH. Ukupna RC struktura je slična tropodjediničnoj RC srodnih vrsta (kao što je Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Makrociklusi BChl i BPh, karotenoidni lanac i ne-hemsko željezo se preklapaju unutar raspona rezolucije ovih struktura, kao i UQ10 glavna grupa na QA mjestu i QB kinon na RC-LH116 (Slika S15).
Dostupnost dvije RC strukture s različitim stopama zauzetosti QB mjesta pruža novu priliku za ispitivanje konzistentnih konformacijskih promjena koje prate vezivanje QB kinona. U RC-LH116 kompleksu, QB kinon se nalazi u potpuno vezanom "proksimalnom" položaju (26), ali odvajanje RC-LH114-W nema QB kinona. U RC-LH114-W nema QB kinona, što je iznenađujuće jer je kompleks aktivan, više nego RC-LH116 kompleks sa strukturno razdvojenim QB kinonom. Iako dva LH1 prstena keliraju oko šest kinona, pet je strukturno razdvojeno u zatvorenom RC-LH116 prstenu, dok su samo tri strukturno ograničena u otvorenom RC-LH114-W prstenu. Ovaj povećani strukturni poremećaj može odražavati bržu zamjenu QB mjesta RC-LH114-W, bržu kinetiku kinona u kompleksu i povećanu vjerovatnoću prelaska LH1 petlje. Pretpostavljamo da nedostatak UQ-a na RC QB mjestu RC-LH114-W može biti rezultat složenijeg i aktivnijeg kompleksa, te da je QB mjesto RC-LH114-W odmah zamrznuto u UQ prometu. Specifična faza (ulaz na QB mjesto je zatvoren) odražava konformaciju ove aktivnosti.
Bez QB, prateća rotacija L-Phe217 u položaj koji nije kompatibilan s vezivanjem UQ10, jer će uzrokovati prostorni sudar s prvom izoprenskom jedinicom repa (Slika 6A). Osim toga, očigledne glavne konformacijske promjene su očigledne, posebno helix de (kratka spirala u petlji između TMH D i E) gdje je L-Phe217 pomjeren u džep za vezivanje QB i rotacija L-Tyr223 (Slika 6A) kako bi se prekinula vodikova veza s M-Asp45 okvirom i zatvorio ulaz mjesta vezivanja QB (Slika 6B). Helix de se okreće u svojoj bazi, Cα L-Ser209 je pomjeren za 0,33 Å, dok je L-Val221Cα pomjeren za 3,52 Å. Nema uočljivih promjena u TMH D i E, koje se mogu preklopiti u obje strukture (Slika 6A). Koliko znamo, ovo je prva struktura u prirodnom RC-u koja zatvara QB mjesto. Poređenje sa kompletnom (QB-vezanom) strukturom pokazuje da je prije redukcije kinona potrebna konformacijska promjena da bi ušao u kinon. L-Phe217 rotira i formira π-interakciju slaganja sa glavnom grupom kinona, a heliks se pomiče prema van, omogućavajući skeletu L-Gly222 i bočnom lancu L-Tyr223 da formiraju mrežu vodikovih veza sa stabilnom strukturom vodikovih veza (Slika 6, A i C).
(A) Preklapajući crtež holograma (L lanac, narandžasta/M lanac, magenta) i apo (siva) strukture, u kojem su ključni ostaci prikazani u obliku štapićastog prikaza. UQ10 je predstavljen žutom trakom. Isprekidana linija označava vodikove veze formirane u cijeloj strukturi. (B i C) Površinski prikaz apolipoproteina i cijele prstenaste strukture, s istaknutim kisikom u bočnom lancu L-Phe217 plavom bojom i L-Tyr223 crvenom bojom. L podjedinica je narandžasta; M i H podjedinice nisu obojene. (D i E) Apolipoprotein (D) i cijela (E) RC QB mjesta [obojena prema (A) respektivno] i Thermophilus thermophilus PSII (zelena, plava s plastičnim kinonom; PDB ID: 3WU2) Poravnanje (58).
Neočekivano, iako je dostupno nekoliko struktura RC-ova s ​​nedostatkom QB-a bez LH1, konformacijske promjene uočene u ovoj studiji nisu ranije objavljene. To uključuje strukturu osiromašenog QB-a iz Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) i Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), a sve su gotovo iste kao i njihova ukupna QB struktura. Detaljnim pregledom 3PRC otkriveno je da se molekule deterdženta LDAO (lauril dimetil amin oksid) vežu na ulazu u QB poziciju, što može spriječiti preuređenje u zatvorenu konformaciju. Iako se LDAO ne razgrađuje na istoj poziciji u 1EYS ili 1OGV, ovi RC-ovi se pripremaju korištenjem istog deterdženta i stoga mogu proizvesti isti učinak. Kristalna struktura Rba. Sphaeroides RC kokristaliziran s citokromom c2 (PDB ID: 1L9B) također izgleda ima zatvoreno QB mjesto. Međutim, u ovom slučaju, N-terminalna regija RC-M polipeptida (koja interagira s mjestom vezivanja QB putem H veze Tyr ostatka na Q heliksu) usvaja neprirodnu konformaciju, a promjena konformacije QB nije dalje istražena (30). Ono što je utješno je da nismo vidjeli ovu vrstu deformacije M polipeptida u strukturi RC-LH114-W, koja je gotovo ista kao N-terminalna regija RC-LH116 RC. Također treba napomenuti da su nakon uklanjanja LH1 antene na bazi deterdženta, RC-ovi apolipoproteina u PDB-u razriješeni, što je eliminiralo unutrašnje kinonske bazene i lipide u praznini između RC i unutrašnje površine okolnog LH1 prstena (31, 32). RC ostaje funkcionalan jer zadržava sve kofaktore, osim razgradivog QB kinona, koji je manje stabilan i često se gubi tokom procesa pripreme (33). Osim toga, poznato je da uklanjanje LH1 i prirodnih cikličkih lipida iz RC može imati utjecaj na funkcije, kao što je skraćeni vijek trajanja P+QB-stanja odvojenog nabojem (31, 34, 35). Stoga, nagađamo da postojanje lokalnog LH1 prstena koji okružuje RC može održavati "zatvoreno" QB mjesto, čime se čuva lokalno okruženje u blizini QB.
Iako apolipoprotein (bez QB kinona) i kompletna struktura predstavljaju samo dva snimka prometa QB mjesta, a ne niz događaja, postoje indikacije da vezivanje može biti ograničeno kako bi se spriječilo ponovno vezivanje hidrokinonom kako bi se inhibirala inhibicija supstrata. Interakcija kinolola i kinona u blizini QB mjesta apolipoproteina može biti različita, što dovodi do njegovog odbacivanja od strane RC. Odavno je predloženo da konformacijske promjene igraju ulogu u vezivanju i redukciji kinona. Sposobnost smrznutih RC-a da redukuju kinone nakon adaptacije na tamu je smanjena (36); rendgenska kristalografija pokazuje da je ovo oštećenje posljedica QB kinona koji su zarobljeni u "distalnoj" konformaciji oko 4,5 Å od aktivnog proksimalnog položaja (26, 37). Predlažemo da je ova distalna konformacija vezivanja snimak međustanja između apolipoproteina i pune prstenaste strukture, koje slijedi nakon početne interakcije s kinonom i otvaranja QB mjesta.
RC tipa II pronađen u PSII kompleksu određenih fototrofnih bakterija i cijanobakterija, algi i biljaka ima strukturnu i funkcionalnu konzervaciju (38). Strukturno poravnanje prikazano na Slici 6 (D i E) naglašava sličnost između PSII RC i QB mjesta bakterijskog RC kompleksa. Ovo poređenje je dugo bilo model za proučavanje blisko povezanih sistema vezivanja i redukcije kinona. Prethodne publikacije sugerišu da su konformacijske promjene praćene PSII redukcijom kinona (39, 40). Stoga, uzimajući u obzir evolucijsku konzervaciju RC, ovaj prethodno neuočeni mehanizam vezivanja može biti primjenjiv i na QB mjesto PSII RC u oksigeniranim fototrofnim biljkama.
Sojevi Rps ΔpufW (neobilježena pufW delecija) i PufW-His (C-terminalni 10x His-označeni protein-W eksprimiran iz prirodnog pufW lokusa). palustris CGA009 je opisan u našem prethodnom radu (16). Ovi sojevi i izogeni roditelj divljeg tipa su izvađeni iz zamrzivača nanošenjem malog broja ćelija na PYE (svaka 5 g litar -1) (čuvanu u LB na -80 °C, koja sadrži 50% (w/v) glicerol) proteina, ekstrakt kvasca i sukcinat) agar [1,5% (w/v)]. Ploča je inkubirana preko noći u mraku na sobnoj temperaturi pod anaerobnim uslovima, a zatim osvijetljena bijelim svjetlom (~50 μmolm-2 s-1) koje su obezbijedile OSRAM 116-W halogene sijalice (RS Components, UK) tokom 3 do 5 dana dok se nije pojavila jedna kolonija. Jedna kolonija je korištena za inokulaciju 10 ml M22+ medija (41) dopunjenog sa 0,1% (w/v) kazeaminokiselina (u daljnjem tekstu M22). Kultura je uzgajana u uslovima niskog kiseonika u mraku na 34°C uz mućkanje pri 180 rpm tokom 48 sati, a zatim je 70 ml kulture inokulirano pod istim uslovima tokom 24 sata. Poluaerobna kultura zapremine 1 ml koristi se za inokulaciju 30 ml M22 medija u univerzalnoj prozirnoj staklenoj boci sa navojnim čepom od 30 ml i ozračuje se uz mućkanje (~50μmolm-2 s-1) tokom 48 sati sterilnom magnetnom miješalicom. Zatim je 30 ml kulture inokulirano sa oko 1 litrom kulture pod istim uslovima, koja je potom korištena za inokulaciju oko 9 litara kulture osvijetljene pri ~200 μmolm-2 s-1 tokom 72 sata. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 7132 RCF tokom 30 minuta, resuspendovane u ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) i čuvane na -20°C do upotrebe.
Nakon odmrzavanja, resuspendiranim ćelijama dodajte nekoliko kristala deoksiribonukleaze I (Merck, UK), lizozima (Merck, UK) i dvije tablete inhibitora proteaze holoenzima Roche (Merck, UK). U francuskoj ćeliji pod pritiskom od 20.000 psi (Aminco, SAD), ćelije su razbijene 8 do 12 puta. Nakon uklanjanja nerazbijenih ćelija i nerastvorljivih ostataka centrifugiranjem na 18.500 RCF tokom 15 minuta na 4°C, membrana je istaložena iz pigmentiranog lizata centrifugiranjem na 113.000 RCF tokom 2 sata na 43.000°C. Odbacite rastvorljivu frakciju i resuspendirajte obojenu membranu u 100 do 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) i homogenizirajte dok ne nestanu vidljivi agregati. Suspendirana membrana je inkubirana u 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, SAD) koji sadrži 2% (w/v) β-DDM tokom 1 sata u mraku na 4°C uz lagano miješanje. Zatim je centrifugirana na 70°C da bi se rastvorilo 150.000 RCF na 4°C tokom 1 sata radi uklanjanja preostalih nerastvorljivih materija.
Solubilizirajuća membrana iz soja ΔpufW nanesena je na 50 ml DEAE Sepharose kolonu za jonsku izmjenu s tri volumena kolone (CV) pufera za vezivanje [20 mM tris-HCl (pH 8,0) koji sadrži 0,03% (w/v) β-DDM]. Kolonu je isprati s dva CV pufera za vezivanje, a zatim s dva pufera za vezivanje koja sadrže 50 mM NaCl. RC-LH116 kompleks je eluiran linearnim gradijentom od 150 do 300 mM NaCl (u puferu za vezivanje) na 1,75 CV, a preostali kompleks za vezivanje je eluiran puferom za vezivanje koji sadrži 300 mM NaCl na 0,5 CV. Sakupiti apsorpcijski spektar između 250 i 1000 nm, održavati frakciju s omjerom apsorbancije (A880/A280) većim od 1 na 880 do 280 nm, razrijediti je dva puta u puferu za vezivanje i ponovo koristiti isti postupak na DEAE koloni prilikom pročišćavanja. Razrijediti frakcije s omjerima A880/A280 većim od 1,7 i omjerima A880/A805 većim od 3,0, provesti treći krug ionske izmjene i zadržati frakcije s omjerima A880/A280 većim od 2,2 i omjerima A880/A805 većim od 5,0. Djelomično pročišćeni kompleks je koncentriran na ~2 ml u centrifugalnom filteru Amicon 100.000 molekularne težine s granicom od 100.000 (MWCO) (Merck, UK) i nanesen na kolonu za isključivanje po veličini Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, SAD) koja sadrži 200 mM NaCl pufer, a zatim eluiran u istom puferu pri 1,5 CV. Sakupite apsorpcijske spektre frakcije isključivanja veličine i koncentrirajte apsorpcijske spektre s omjerima A880/A280 preko 2,4 i omjerima A880/A805 preko 5,8 do 100 A880, te ih odmah koristite za pripremu ili skladištenje krio-TEM mreže. Čuvajte na -80°C dok ne budu potrebni.
Solubilizirajuća membrana iz soja PufW-His nanesena je na 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose kolonu (20 mM tris-HCl (pH 8,0) koja sadrži 200 mM NaCl i 0,03% (w/w)) u IMAC puferu (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolona je isprana sa pet CV IMAC pufera, a zatim sa pet CV IMAC pufera koji sadrži 10 mM histidina. Jezgro kompleksa je eluirano iz kolone sa pet IMAC pufera koji sadrže 100 mM histidina. Frakcija koja sadrži RC-LH114-W kompleks je koncentrirana na ~10 ml u mješalici opremljenoj Amicon 100,000 MWCO filterom (Merck, UK), razrijeđena 20 puta puferom za vezivanje, a zatim dodana u 25 ml DEAE Sepharose kolone. U DEAE Sepharose koloni, unaprijed su korištena četiri CV vezana za pufer. Kolonu isprati sa četiri CV pufera za vezivanje, zatim eluirati kompleks na osam CV-a na linearnom gradijentu od 0 do 100 mM NaCl (u puferu za vezivanje), a preostala četiri CV-a sadrže 100 mM pufer za vezivanje. Preostali kompleksi eluirani na natrijum hloridu u kombinaciji sa frakcijama sa odnosom A880/A280 većim od 2,4 i odnosom A880/A805 većim od 4,6 koncentrisani su na ~2 ml u centrifugalnom filteru Amicon 100.000 MWCO i napunjeni sa 1,5 CV IMAC unaprijed puferski uravnoteženom kolonom za isključivanje po veličini Superdex 200 16/600, a zatim eluirani u istom puferu preko 1,5 CV. Sakupite apsorpcijske spektre frakcija isključivanja veličine i koncentrirajte apsorpcijske spektre s omjerima A880/A280 preko 2,1 i omjerima A880/A805 preko 4,6 do 100 A880, koji se odmah koriste za pripremu smrznute TEM mreže ili čuvaju na -80°C do potrebe.
Za pripremu TEM mreža za niske temperature korišten je Leica EM GP imerzioni zamrzivač. Kompleks je razrijeđen u IMAC puferu do A880 od 50, a zatim je 5 μl naneseno na novoizbačenu QUANTIFOIL 1.2/1.3 bakrenu mrežicu obloženu ugljikom (Agar Scientific, UK) pod žarenjem. Mrežu je potrebno inkubirati na 20°C i 60% relativne vlažnosti tokom 30 sekundi, zatim je osušiti upijajućim papirom tokom 3 sekunde, a zatim ugasiti u tekućem etanu na -176°C.
Podaci RC-LH114-W kompleksa snimljeni su na eBIC-u (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) pomoću Titan Krios mikroskopa, koji radi na ubrzavajućem naponu od 300kV, s nominalnim uvećanjem od 130.000× i energijom od - Odaberite razmak od 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum s K2 detektorom vrhova korišten je za snimanje slika u načinu brojanja radi prikupljanja podataka. Kalibrirana veličina piksela je 1,048 Å, a brzina doze je 3,83 e-Å-2s-1. Film je prikupljen za 11 sekundi i podijeljen na 40 dijelova. Koristi se područje obloženo ugljikom za ponovno fokusiranje mikroskopa, a zatim su prikupljena tri filma po rupi. Ukupno je prikupljeno 3130 filmova, s vrijednostima defokusiranja između -1 i -3μm.
Podaci za RC-LH116 kompleks prikupljeni su korištenjem istog mikroskopa u Asterbury Biostructure Laboratory (Univerzitet u Leedsu, UK). Podaci su prikupljeni u režimu brojanja s uvećanjem od 130 k, a veličina piksela je kalibrirana na 1,065 Å s dozom od 4,6 e-Å-2s-1. Film je snimljen za 12 sekundi i podijeljen u 48 dijelova. Ukupno je prikupljeno 3359 filmova, s vrijednostima defokusiranja između -1 i -3μm.
Sva obrada podataka se vrši u Relion 3.0 cjevovodu (42). Koristite Motioncorr 2 (43) za korekciju kretanja snopa ponderiranjem doze, a zatim koristite CTFFIND 4.1 (44) za određivanje parametra CTF (funkcija prijenosa kontrasta). Tipične fotomikrografije nakon ovih početnih faza obrade prikazane su na Slici 2. S16. Predložak automatskog odabira generira se ručnim odabirom oko 250 piksela od 1000 čestica u okviru od 250 piksela i bez referentne dvodimenzionalne (2D) klasifikacije, čime se odbacuju one klasifikacije koje zadovoljavaju zahtjeve za kontaminaciju uzorka ili nemaju uočljive karakteristike. Zatim je izvršen automatski odabir na svim mikrofotografijama, a RC-LH114-W je imao 849.359 čestica, a RC-LH116 kompleks 476.547 čestica. Sve odabrane čestice su prošle dva kruga nereferentne 2D klasifikacije, i nakon svakog ciklusa, čestice koje zadovoljavaju uslove za područje ugljika, kontaminaciju uzorka, bez očiglednih karakteristika ili čestice koje se snažno preklapaju se odbacuju, što je rezultiralo sa 772.033 (90,9%) i 359.678 (75,5%) čestica koje se koriste za 3D klasifikaciju RC-LH114-W i RC-LH116, respektivno. Početni 3D referentni model generiran je korištenjem metode stohastičkog gradijentnog spusta. Koristeći početni model kao referencu, odabrane čestice su klasificirane u četiri kategorije u 3D. Koristeći model u ovoj kategoriji kao referencu, izvršite 3D pročišćavanje čestica u najvećoj kategoriji, zatim koristite početni niskopropusni filter od 15 Å da biste pokrili područje rastvarača, dodajte 6 piksela mekih rubova i naknadno obradite piksele da biste korigovali Gatan K2 vršnu modulacionu prijenosnu funkciju gornjeg detektora. Za skup podataka RC-LH114-W, ovaj početni model je modificiran uklanjanjem jake gustoće na rubovima maske (odvojene od gustoće jezgra u UCSF Chimeri). Rezultirajući modeli (rezolucije RC-LH114-W i RC-LH116 su 3,91 i 4,16 Å, respektivno) koriste se kao referenca za drugi krug 3D klasifikacije. Korištene čestice su grupirane u početnu 3D klasu i ne sadrže jaku korelaciju sa susjedstvom. Preklapanje ili nedostatak očiglednih strukturnih karakteristika. Nakon drugog kruga 3D klasifikacije, odabrana je kategorija s najvećom rezolucijom [Za RC-LH114-W, jedna kategorija je 377.703 čestice (44,5%), za RC-LH116 postoje dvije kategorije, ukupno 260.752 čestice (54,7%), gdje su iste samo kada su poravnate nakon početne rotacije s malom razlikom]. Odabrane čestice se ponovo ekstrahuju u kutiji od 400 piksela i pročišćavaju 3D pročišćavanjem. Maska rastvarača se generiše korištenjem početnog niskopropusnog filtera od 15 Å, proširenja mape od 3 piksela i meke maske od 3 piksela. Korištenjem pročišćavanja CTF-a po čestici, korekcije kretanja po čestici i drugog kruga pročišćavanja CTF-a po čestici, 3D pročišćavanje, maskiranje rastvarača i naknadna obrada se izvode nakon svakog koraka kako bi se dodatno pročistila rezultirajuća tekstura. Korištenjem granične vrijednosti FSC-a (Fourier Shell Correlation Coefficient) od 0,143, rezolucije konačnih modela RC-LH114-W i RC-LH116 su 2,65 odnosno 2,80 Å. FSC krivulja konačnog modela prikazana je na Slici 2. S17.
Sve proteinske sekvence su preuzete sa UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) je korišten za konstrukciju homolognog modela RC, koji sadrži proteinske sekvence RC-L, RC-M i RC-H, a kristalna struktura Rba. sphaeroides RC je korištena kao predložak (PDB ID: 5LSE) (46). Koristite alat „fit map“ u UCSF Chimera da biste prilagodili generirani model mapi (47), poboljšali strukturu proteina i dodali kofaktor [4×BChl a (naziv ostatka u biblioteci monomera = BCL), 2×BPh a (BPH), jednu ili dvije vrste UQ10 (U10), jedno ne-hemsko željezo (Fe) i jedan 3,4-dihidroheksakarbonilholin (QAK)] pomoću Coota (48). Budući da QAK nije dostupan u biblioteci monomera, parametriziran je pomoću alata eLBOW u PHENIX-u (49).
Zatim je konstruirana LH1 podjedinica. U početku je alat za automatsku konstrukciju u PHENIX-u (49) korišten za automatsku konstrukciju dijela LH1 sekvence koristeći mapu i LH1-α i LH1-β proteinske sekvence kao ulaz. Odaberite najkompletniju LH1 podjedinicu, izdvojite je i učitajte u Coot, ručno dodajte nedostajuću sekvencu i ručno pročistite cijelu strukturu prije dodavanja dva BCl a (BCL) i spiriloksantina (CRT) [prema relevantnim Rps gustoći LH1 kompleksa i poznatom sadržaju karotenoida. Vrsta (17)]. Kopirajte kompletnu LH1 podjedinicu i koristite UCSF Chimera "Docking Map Tool" za pristajanje u susjedno područje LH1 gustoće koje nije model, a zatim ga pročistite u Coot-u; ponavljajte postupak dok se ne modeliraju sve LH1 podjedinice. Za strukturu RC-LH114-W, izdvajanjem nedodijeljene gustoće u Coot-u, protein se segmentira od preostalih neproteinskih komponenti na USCF Chimera mapi, a alat Autobuild se koristi za uspostavljanje početnog modela i modeliranja preostalih podjedinica (protein-W). U PHENIX-u (49). Dodajte sve nedostajuće sekvence rezultirajućem modelu u Coot-u (48), a zatim ručno pročistite cijelu podjedinicu. Preostala nedodijeljena gustoća odgovara kombinaciji lipida (PDB monomerna biblioteka ID CDL = CDL, POPC = 6PL i POPG = PGT), β-DDM deterdženta (LMT) i UQ10 molekula (U10). Koristite PHENIX optimizaciju (49) i ručnu optimizaciju u Coot-u (48) da biste usavršili kompletan početni model sve dok se statistika modela i vizualni kvalitet prilagođavanja ne mogu dalje poboljšati. Konačno, koristite LocScale (50) da biste izoštrili lokalnu mapu, a zatim izvršite nekoliko drugih ciklusa modeliranja nedodijeljene gustoće i automatske i ručne optimizacije.
Odgovarajući peptidi, kofaktori i ostali lipidi i kinoni usidreni unutar njihovih odgovarajućih gustoća prikazani su na slikama 1 i 2. S18 do S23. Statističke informacije konačnog modela prikazane su u tabeli S1.
Osim ako nije drugačije navedeno, UV/Vis/NIR apsorpcijski spektri su prikupljeni na spektrofotometru Cary60 (Agilent, SAD) u intervalima od 1 nm od 250 nm do 1000 nm i vremenom integracije od 0,1 s.
Razrijediti uzorak u kvarcnoj kiveti s putanjom od 2 mm do A880 od 1 i sakupiti apsorpcijski spektar između 400 i 1000 nm. Kružni dihroični spektri su sakupljeni na Jasco 810 spektropolarimetru (Jasco, Japan) u intervalima od 1 nm između 400 nm i 950 nm pri brzini skeniranja od 20 nm min-1.
Molarni koeficijent ekstinkcije određuje se razrjeđivanjem osnovnog kompleksa na A880 od približno 50. Razrijedite volumen od 10 μl u 990 μl pufera za vezivanje ili metanola i odmah sakupite apsorpcijski spektar kako biste smanjili degradaciju BChl. Sadržaj BChl svakog uzorka metanola izračunat je koeficijentom ekstinkcije na 771 nm od 54,8 mM-1 cm-1, a koeficijent ekstinkcije je određen (51). Izmjerenu koncentraciju BChl podijelite sa 32 (RC-LH114-W) ili 36 (RC-LH116) da biste odredili koncentraciju osnovnog kompleksa, koja se zatim koristi za određivanje apsorpcijskog spektra istog uzorka sakupljenog u puferu. Koeficijent ekstinkcije. paralelno. Tri ponovljena mjerenja su izvršena za svaki uzorak, a prosječna apsorbancija BChl Qy maksimuma je korištena za izračunavanje. Koeficijent ekstinkcije RC-LH114-W mjeren na 878 nm iznosi 3280±140 mM-1 cm-1, dok je koeficijent ekstinkcije RC-LH116 mjeren na 880 nm 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 je kvantificiran prema metodi u (52). Ukratko, HPLC reverzne faze (RP-HPLC) je proveden korištenjem Agilent 1200 HPLC sistema. Rastvoriti oko 0,02 nmol RC-LH116 ili RC-LH114-W u 50 μl 50:50 metanol:hloroforma koji sadrži 0,02% (w/v) željeznog hlorida i ubrizgati prethodno uravnoteženi Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm rastvoren u 1 ml-1 min-1 na 40°C u HPLC rastvaraču (80:20 metanol:2-propanol) na kolonu ×25 cm. Izvršiti izokratsku eluciju u HPLC rastvaraču kako bi se pratila apsorbancija na 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoidi) i 780 nm (BChl) tokom 1 sata. Integrisan je vrh na hromatogramu na 275 nm na 25,5 minuta, koji nije sadržavao nikakve druge detektabilne spojeve. Integrisana površina se koristi za izračunavanje molarne količine ekstrahovanog UQ10 u odnosu na kalibracionu krivulju izračunatu injekcijom čistih standarda od 0 do 5,8 nmol (Slika S14). Svaki uzorak je analiziran u tri ponavljanja, a prijavljena greška odgovara standardnoj devijaciji prosjeka.
Rastvor koji sadrži RC-LH1 kompleks sa maksimalnom Qy apsorpcijom od 0,1 pripremljen je sa 30 μM reduciranog citokroma c2 iz konjskog srca (Merck, UK) i 0 do 50 μMUQ2 (Merck, UK). Tri uzorka od 1 ml pripremljena su pri svakoj koncentraciji UQ2 i inkubirana preko noći u mraku na 4°C kako bi se osigurala potpuna adaptacija na mrak prije mjerenja. Rastvor je stavljen u OLIS RSM1000 modularni spektrofotometar opremljen rešetkom plamena od 300 nm/500 linija, ulaznim prorezima od 1,24 mm, srednjim prorezima od 0,12 mm i izlaznim prorezima od 0,6 mm. Filter dužine 600 nm postavljen je na ulaz fotocijevi za uzorak i referentne fotomultiplikatorske cijevi kako bi se isključila pobudna svjetlost. Apsorbancija je praćena na 550 nm sa vremenom integracije od 0,15 s. Pobudna svjetlost se emituje iz 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) putem optičkog kabla intenziteta 90% putem DC2200 kontrolera (Thorlabs Ltd., UK) i emituje se prema izvoru svjetlosti pod uglom od 90°. Mjerni snop je usmjeren nasuprot ogledalu kako bi se vratila svjetlost koju uzorak prvobitno nije apsorbovao. Pratite apsorbanciju 10 sekundi prije osvjetljenja od 50 sekundi. Zatim je apsorbancija dodatno praćena 60 sekundi u mraku kako bi se procijenio stepen u kojem kinolol spontano redukuje citohrom c23+ (vidi Sliku S8 za sirove podatke).
Podaci su obrađeni prilagođavanjem linearne početne brzine unutar 0,5 do 10 s (ovisno o koncentraciji UQ2) i usrednjavanjem brzina sva tri uzorka pri svakoj koncentraciji UQ2. Koncentracija RC-LH1 izračunata odgovarajućim koeficijentom ekstinkcije korištena je za pretvaranje brzine u katalitičku efikasnost, prikazanu u Origin Pro 2019 (OriginLab, SAD), i prilagođenu Michaelis-Menten modelu za određivanje prividnih vrijednosti Km i Kcat.
Za mjerenja tranzijentne apsorpcije, uzorak RC-LH1 je razrijeđen na ~2μM u IMAC puferu koji sadrži 50 mM natrijum askorbata (Merck, SAD) i 0,4 mM terbutina (Merck, SAD). Askorbinska kiselina se koristi kao žrtveni donor elektrona, a tert-butaklofen se koristi kao QB inhibitor kako bi se osiguralo da glavni RC donor ostane reduciran (tj. da se ne fotooksidira) tokom cijelog procesa mjerenja. Otprilike 3 ml uzorka se dodaje u prilagođenu rotirajuću ćeliju (promjera oko 0,1 m, 350 RPM) s dužinom optičkog puta od 2 mm kako bi se osiguralo da uzorak u laserskom putu ima dovoljno vremena za adaptaciju na tamu između impulsa pobude. Koristite laserske impulse od ~100 fs za pojačavanje Ti:Sapphire laserskog sistema (Spectra Physics, SAD) kako biste pobudili uzorak na 880 nm pri brzini ponavljanja od 1 kHz (20 nJ za NIR ili 100 nJ za Vis). Prije prikupljanja podataka, izložite uzorak pobudnoj svjetlosti oko 30 minuta. Izloženost će uzrokovati inaktivaciju QA (moguće smanjenje QA jednom ili dva puta). Međutim, imajte na umu da je ovaj proces reverzibilan jer će se nakon dugog perioda adaptacije na tamu, RC polako vratiti QA aktivnosti. Helios spektrometar (Ultrafast Systems, SAD) korišten je za mjerenje prolaznih spektara s vremenom kašnjenja od -10 do 7000 ps. Koristite Surface Xplorer softver (Ultrafast Systems, SAD) za razgrupiranje skupova podataka, a zatim spajanje i standardizaciju. Koristite CarpetView softverski paket (Light Conversion Ltd., Litvanija) za korištenje kombinovanog skupa podataka za dobijanje diferencijalnih spektara povezanih s raspadom ili koristite funkciju koja konvolvira više eksponenata s odzivom instrumenta kako bi se prilagodila spektralnoj evoluciji jedne talasne dužine u Origin-u (OriginLab, SAD).
Kao što je gore spomenuto (53), pripremljen je fotosintetski film koji sadrži LH1 kompleks kojem nedostaju i RC i periferna LH2 antena. Membrana je razrijeđena u 20 mM tris (pH 8,0), a zatim stavljena u kvarcnu kivetu s optičkim putem od 2 mm. Laserski impuls od 30 nJ korišten je za pobuđivanje uzorka na 540 nm s vremenom kašnjenja od -10 do 7000 ps. Obradite skup podataka kao što je opisano za uzorak Rps.pal.
Membrana je peletirana centrifugiranjem pri 150.000 RCF tokom 2 sata na 4°C, a zatim je njena apsorbancija na 880 nm resuspendirana u 20 mM tris-HCl (pH 8,0) i 200 mM NaCl. Membrana je rastvorena laganim miješanjem u 2% (w/v) β-DDM tokom 1 sata u mraku na 4°C. Uzorak je razrijeđen u 100 mM trietilamonijum karbonatu (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) do koncentracije proteina od 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad analiza). Daljnja obrada je provedena prema prethodno objavljenoj metodi (54), počevši od razrjeđivanja 50 μg proteina u ukupno 50 μl TEAB-a koji sadrži 1% (w/v) natrijum laurata (Merck, UK). Nakon sonikacije tokom 60 sekundi, reduciran je sa 5 mM tris(2-karboksietil)fosfina (Merck, UK) na 37°C tokom 30 minuta. Za S-alkilaciju, uzorak se inkubira sa 10 mM metil S-metiltiometansulfonatom (Merck, UK) i dodaje se iz 200 mM izopropanolnog osnovnog rastvora tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Proteolitička digestija je provedena dodavanjem 2 μg smjese tripsina/endoproteinaze Lys-C (Promega UK) i inkubirana na 37°C tokom 3 sata. Lauratni surfaktant je ekstrahovan dodavanjem 50 μl etil acetata i 10 μl 10% (v/v) trifluorosirćetne kiseline LC kvalitete (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) i vrtloženjem tokom 60 sekundi. Fazno razdvajanje je ubrzano centrifugiranjem na 15.700 RCF tokom 5 minuta. Prema protokolu proizvođača, korištena je C18 spin kolona (Thermo Fisher Scientific, UK) za pažljivo aspiriranje i odsoljavanje donje faze koja sadrži peptid. Nakon sušenja vakuumskim centrifugiranjem, uzorak je rastvoren u 0,5% TFA i 3% acetonitrila, a 500 ng je analizirano nanoflow RP hromatografijom u kombinaciji sa masenom spektrometrijom koristeći sistemske parametre detaljno opisane ranije.
Koristite MaxQuant v.1.5.3.30 (56) za identifikaciju i kvantifikaciju proteina kako biste pretražili bazu podataka proteoma Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Podaci proteomike masene spektrometrije pohranjeni su u ProteomeXchange Alliance putem partnerskog repozitorija PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) pod identifikatorom skupa podataka PXD020402.
Za analizu RPLC-om u kombinaciji s masenom spektrometrijom s elektrosprejnom ionizacijom, RC-LH1 kompleks je pripremljen iz divljeg tipa Rps. Korištenjem prethodno objavljene metode (16), koncentracija proteina proizvedena u ćelijama palustrisa bila je 2 mg ml-1 u 20 mM Hepes-a (pH 7,8), 100 mM NaCl i 0,03% (w/v) β-(Bio-Rad analiza)) DDM-a. Prema protokolu proizvođača, koristite 2D komplet za prečišćavanje (GE Healthcare, SAD) za ekstrakciju 10 μg proteina metodom precipitacije i otopite precipitat u 20 μl 60% (v/v) mravlje kiseline (FA), 20% (v/v) acetonitrila i 20% (v/v) vode. Pet mikrolitara je analizirano RPLC-om (Dionex RSLC) u kombinaciji s masenom spektrometrijom (Maxis UHR-TOF, Bruker). Koristite MabPac kolonu 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) za separaciju na 60°C i 100 μlmin -1, sa gradijentom od 85% (v/v) rastvarača A [0,1% (v/v) FA i 0,02% (V/v) vodenog rastvora TFA] do 85%(v/v) rastvarača B [0,1%(v/v) FA i 0,02%(v/v) u 90%(v/v) acetonitrilu TFA]. Koristeći standardni izvor jonizacije elektrosprejem i zadane parametre duže od 60 minuta, maseni spektrometar postiže od 100 do 2750 m/z (odnos mase i naboja). Uz pomoć alata FindPept na portalu bioinformatičkih resursa ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mapirajte maseni spektar na podjedinice kompleksa.
Ćelije su uzgajane 72 sata pod 100 ml NF-niskog (10μMm-2 s-1), srednjeg (30μMm-2 s-1) ili jakog (300μMm-2 s-1) svjetla. M22 medij (M22 medij u kojem je amonijum sulfat izostavljen, a natrijum sukcinat zamijenjen natrijum acetatom) u bočici od 100 ml sa navojnim čepom (23). U pet ciklusa od 30 sekundi, staklene kuglice od 0,1 mikrona su dodavane u volumenskom omjeru 1:1 radi lize ćelija i hlađene na ledu 5 minuta. Nerastvorljiva materija, nerazbijene ćelije i staklene kuglice su uklonjene centrifugiranjem na 16.000 RCF tokom 10 minuta u stolnoj mikrocentrifugi. Membrana je odvojena u Ti 70.1 rotoru sa 100.000 RCF u 20 mM tris-HCl (pH 8,0) sa gradijentom saharoze 40/15% (w/w) tokom 10 sati.
Kao što je opisano u našem prethodnom radu, imunodetekcija His oznake na PufW (16). Ukratko, pročišćeni jezgreni kompleks (11,8 nM) ili membrana koja sadrži istu koncentraciju RC (određenu oksidacijom oduzimanjem reduciranog spektra razlike i usklađivanjem opterećenja na obojenom gelu) u 2x SDS puferu za punjenje (Merck, UK) razrijeđenom dva puta. Proteini su odvojeni na replici 12% bis-tris NuPage gela (Thermo Fisher Scientific, UK). Gel je obojen Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) za punjenje i vizualizaciju RC-L podjedinice. Protein na drugom gelu je prenesen na metanolom aktiviranu poliviniliden fluoridnu (PVDF) membranu (Thermo Fisher Scientific, UK) za imunološki test. PVDF membrana je blokirana u 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 i 5% (w/v) obranom mlijeku u prahu, a zatim inkubirana sa primarnim anti-His antitijelom (u puferu za razrjeđivanje antitijela [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl i 0,05% (v/v) Tween-20] u 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, SAD) tokom 4 sata. Nakon ispiranja 3 puta po 5 minuta u puferu za antitijela, membrana je kombinirana sa sekundarnim antitijelom protiv miša iz hren peroksidaze (Sigma-Aldrich, UK) (razrijeđeno 1:10.000 u puferu za antitijela). Inkubirano je da se omogući detekcija (5 minuta nakon 3 ispiranja u puferu za antitijela) korištenjem WESTAR ETA C 2.0 hemiluminiscentne podloge (Cyanagen, Italija) i Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Crtanjem distribucije intenziteta svakog obojenog gela ili imunotest trake, integriranjem površine ispod vrha i izračunavanjem odnosa intenziteta RC-L (obojeni gel) i Protein-W (imunotest), u ImageJ (57) obradite sliku. Ovi omjeri su pretvoreni u molarne omjere pretpostavkom da je odnos RC-L i protein-W u čistom uzorku RC-LH114-W bio 1:1 i normalizacijom cijelog skupa podataka u skladu s tim.
Za dodatne materijale za ovaj članak, pogledajte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod uslovima Creative Commons Attribution licence. Članak dozvoljava neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju pod uslovom da je originalni rad pravilno citiran.
Napomena: Molimo vas da navedete svoju email adresu samo kako bi osoba koju preporučite stranici znala da želite da vidi email i da se ne radi o neželjenoj pošti. Nećemo prikupljati email adrese.
Ovo pitanje se koristi za provjeru da li ste posjetilac i sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktura visoke rezolucije kompleksa svjetlosne zamke 1 u reakcijskom centru pruža nove uvide u dinamiku kinona.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktura visoke rezolucije kompleksa svjetlosne zamke 1 u reakcijskom centru pruža nove uvide u dinamiku kinona.
©2021 Američko udruženje za unapređenje nauke. sva prava pridržana. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.